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ASIC1a是通过低强度超声刺激小鼠大脑神经元激活所必需的

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  13. 88必唯一官网登录 是通讯作者
  14. 88必唯一官网登录 是通讯作者
  1. 国立台湾大学医学工程学院生物医学工程系,台湾
  2. 国立台湾医院大学物理医学与康复学系,台湾
  3. 台湾中央研究院生物医学研究所
  4. 台湾国立台湾医院大学外科
研究文章
引用这篇文章为:Elife 2021; 10:E61660 doi:10.7554 / eLife.61660

摘要

越来越多的证据表明,经颅低强度超声可以潜在地成为治疗脑疾病的无创神经调节工具。然而,潜在的机制仍然不清楚,大多数使用高强度超声的动物模型的研究不能安全地用于人类。在这里,我们展示了低强度的超声能够激活小鼠大脑中的神经元,重复的超声刺激导致了成人大脑特定区域的神经发生。体外钙成像研究表明,需要一种结合超声诱导压力和声流力学转导的特定超声刺激模式来激活培养的皮层神经元。ASIC1a和细胞骨架蛋白参与了低强度超声介导的机械转导和培养神经元的激活,而这被ASIC1a阻断剂和细胞骨架修饰剂抑制。相比之下,像Piezo或TRP蛋白这样参与双层模型机械传导的机械敏感通道的抑制并不能有效地抑制超声介导的神经元激活。在小鼠大脑中,ASIC1a介导的超声效应,如ERK磷酸化的即时反应和DCX标记的神经发生,被ASIC1a基因缺失显著抑制。经整理的数据表明,ASIC1a是参与低强度超声机械信号调节小鼠大脑神经激活的分子决定因素。

介绍

经颅超声如打开血脑屏障(BBB) (Cammalleri等人,2020年)用于局部药物释放和调节神经活动(尼哥底母等人,2019年Legon et al., 2014David et al., 2014)已被用于各种脑部疾病的治疗。多项体内动物实验及人体临床试验(补充文件1)证实了经颅超声刺激的临床潜力。随着对这项技术的兴趣的增加,超声介导的神经调节机制最近也被了解。一项研究表明,高强度经颅超声可以通过间接听觉机制引发类似惊吓的运动反应(佐藤等人,2018年).在蠕虫模型中出现的声遗传学也识别并设计了TRP-4通道,作为超声刺激的传感器,在压力水平超过0.5 MPa (易卜生等人,2015年),超声在0.1 MPa声压下可通过压电力敏离子通道(Qiu et al., 2019).尽管如此,大多数用于开血脑屏障或神经调节的临床试验或基础研究的能量强度或声压均较高,该技术在临床应用中的安全性问题仍是一个值得关注的问题。

在本研究中,超声强度要低得多,低于10 mW/cm2提出通过机械力敏感离子通道激活哺乳动物大脑中的神经元,具有潜在的临床应用价值。机械敏感离子通道,如PIEZO和TRP通道和酸敏感离子通道(asic) (程等,2018Murthy等人,2017年Nilius和Honoré, 2012)被认为是可能对超声波有反应的候选者。在这里,我们的目标是确定可能的机械传感器在小鼠大脑中可以对低强度超声波作出反应。

结果

经颅超声在小鼠大脑皮层、海马和杏仁核中诱导的p-ERK

我们保持超声暴露在10 mW/cm以下2(我萨塔)在我们的实验中,以确保安全的治疗性适用性。细胞外信号调节激酶(P-ERK)的磷酸化,即时神经元激活的既定指标(高和季,2009),用于评价经颅低强度超声是否能刺激小鼠大脑神经元活动。超声暴露1分钟的小鼠(图1一个)的p-ERK阳性细胞在某些大脑区域,如大脑皮层(图1罪犯),海马(图1比)和杏仁核(图1 h-j),而接受虚假治疗者(补充文件1).更具体地说,p-ERK表达的增加通常发生在超声刺激小鼠皮层的视觉、体感觉、听觉、颞关联、脾后区、梨状区和内嗅区(图1 -图补充2).在海马中,对超声反应的p-ERK信号使CA1和CA2显著减轻,而CA3和齿状回显示稀疏刺激(图1 -图补充2).在杏仁核中,杏仁核中央核的p-ERK信号最强,内侧和基底外侧核的p-ERK信号也明显增加(图1 -图补充2).我们还观察到下丘脑室旁核(PVH)的p-ERK染色始终不变(图1 -图补充),揭示了超声反应的一个有趣的区域特异性。

经颅超声诱导小鼠大脑皮层、海马和杏仁核神经元p-ERK表达。

一个(图:在麻醉小鼠的上颌鼻突和耳轴之间放置1mhz传感器刺激小鼠头部的插图。(B)伪对照小鼠皮质区p-ERK染色的显微图(n = 5),标尺100 μm。假对照小鼠在不开启超声功能发生器的情况下,采用类似的方法将传感器置于头部。(Cb超刺激p-ERK染色皮质区显微图(ISPTA= 5 mW /厘米2(n = 5). (D)可比面积为1.224mm的P-ERK染色电池数量的定量条图2(长1275 μm,宽960 μm),差异显著(Pimagej的细胞计数= 0.0007)。(E)显微照片,代表海马区域,具有深对照小鼠中的P-ERK染色的基础水平。(F)超声刺激小鼠海马区p-ERK染色显微图。(G柱状图显示p-ERK差异显著的细胞计数(1.224 mm2) (P= 0.0132)。(H)模拟对照组杏仁核的显微照片。比例尺100微米(超声刺激小鼠杏仁核的显微图。(J)量化杏仁醇显着差异(P= 0.0023)的p-ERK细胞计数(1.224 mm2).

微管引导超声作为超声与声流结合的机械刺激

为了确定低强度超声是否能机械激活神经元,我们采用体外钙成像方法,用Oregon Green 488 BAPTA-1, AM染色检测培养的皮层神经元对超声机械刺激的可能离子通道。用微管引导超声到培养细胞(图2A).该设备可以产生超声诱导压力的优势条件(2000 mVpp, DF 0.05%,测量峰值压力与移液管尖端的距离,如图所示图2B.)或声流的主要条件(100 mVpp, DF 100%,声流的流型显示在图2 -图补充);(Chu等人,2021年),或混合负载条件(700 mVpp, DF 20%),这取决于所应用的占空比。超声压力优势条件(高达2000 mVpp, DF 0.05%)对无法提高钙反应的细胞产生压迫应力(图2B.视频1),而声流优势条件(高达100 mVpp, DF 100%)所引发的剪切应力只能激活少量的神经元钙反应(图2B.);虽然混合负载条件(700 mVPP,20%DF)有效地产生了更高的钙响应(图2B.视频2).当我们应用另外两种活细胞钙染色试剂时,这种反应也是可重复的,包括氟-4 (视频3)和Fura-2(图2 -图2A视频4),在微管引导的超声刺激下,我们观察到类似的反应。为了证实钙反应不是由脂质双分子层损伤引起的,我们对同一细胞(图2 -图补充2B),并发现尽管由于持续暴露在光照下,存在严重的光衰减问题,但某些亚细胞部位的钙含量会反复升高(白色箭头,图2 -图补充2B).神经元钙反应的量化(图2 -图3A补充),使用Oregon Green 488 BAPTA-1 AM以平均值(图2 -图补充3B),实验以0.01%皂苷细胞穿孔来校准最大响应(图2 -图3C补充).这种方法将用于抑制剂的试验和剂量研究。为了确保这种方法是可靠的,反复刺激细胞,观察到清晰的反应,尽管在第二次刺激时反应的幅度通常下降到30-60% (图2 -图补充3D).仅具有压缩应力的超声波主要模式即使在刺激延长到10秒时也不能引起响应(图2 -图4A).类似地,延长声流调用剪切应力的延长刺激也仅升高了钙响应的幅度(图2 -图补充4B).另一方面,压缩应力与声流的组合可以重复提高钙反应,即使在1.5 s的刺激(图2B.视频2图2 -图补充4C).超声诱导的钙反应呈剂量依赖性,阈值为400 mVpp (8 kPa)和EC50700mvpp (12kpa) (图2C图2 -图补充4D- k).400 mVpp、500 mVpp、700 mVpp、900 mVpp超声对应的应力水平分别为8 kPa、8.72 kPa、12 kPa、15.3 kPa。

ASIC1a抑制剂抑制微管引导超声诱导的神经元钙信号。

一个)放置在皮质神经元上的微管,培养在一个30毫米的盖片上,盖片安装在一个连接到显微镜平台的腔室中。应用Invitrogen Oregon Green 488 BAPTA-1 AM细胞检测神经元钙信号。(B)在输入电压2000mVpp,占空比(DF) 0.05% (n = 5)下,微管超声刺激4个神经元3 s后平均钙信号的折线图;或100mVpp, DF100% (n = 3)或700mVpp, DF20% (n = 4)。红色虚线为刺激开始,黄色虚线为刺激结束。(C微管超声在20%DF中的钙反应。显示了EC50为700mVpp的超声响应的剂量依赖(输入电压从10mVpp到900mVpp, DF20%) (n = 5)。D机械敏感离子通道的非选择性阻断剂钆(120 μM)对皮层神经元钙信号的影响(n = 5)E)选择性Piezo抑制剂GsMTx-4 (500 nM)对皮层神经元钙信号的影响(n = 4)。对照组n = 4。(F)非选择性TRP抑制剂钌红(10 μM)对皮层神经元钙信号的影响(n = 4)。对照n = 6。(GASICs家族抑制剂amiloride (100 μm)对皮层神经元钙信号的影响(n = 4) (H)选择性ASIC1a抑制剂PcTx1处理(50 nM)对皮层神经元钙信号的影响(n = 5) (“脑膜诱导的皮质神经元中的钙信号对沟道阻滞剂的统计分析。对照n = 21,钆(50μm)n = 5,钆(100μm)n = 5,GSMTX-4(500nm)n = 5,钌红色(5μm)n = 5,钌红色(10μm)n = 5,茉莉胺(100μm)n = 5,pctx1(50nm)n = 5。

视频1
当输入电压为2000mVpp,占空比为0.05%时,微管引导超声无法诱导神经元钙信号。

这种设置引起的主要是超声刺激。当视频中出现微吸管尖端的虚线时,开启超声功能发生器。

视频2
微管引导超声刺激神经元钙升高。

输入电压为700mVpp,占空比为20%,持续3 s。当视频中出现微吸管尖端的虚线时,开启超声功能发生器。该设置同时产生了超声波和声流效应。

视频3
微管引导超声刺激神经元钙反应。

超声与250mVpp输入电压和连续波刺激。当视频中出现微吸管尖端的虚线时,开启超声功能发生器。该设置同时产生了超声波和声流效应。

视频4
以400mVpp为输入电压、占空比为10%的微管引导超声诱导Fura-2成像方法捕获的神经元钙信号。

在340 nm/380 nm (F340/380nm).其中红色代表最高比例,紫色代表最低比例的光谱彩色编码荧光比率340/380nm.当视频中出现微吸管尖端的虚线时,开启超声功能发生器。超声设置同时产生超声和声流效应。

ASIC通道抑制剂对超声模拟神经元钙信号的抑制作用

用机械敏感离子通道的选择性或非选择性阻滞剂对微管超声机械转导进行药理学测试。首先,使用钆(10 μM),机械敏感离子通道的非选择性阻滞剂,部分抑制超声诱导的钙信号(图2D).使用选择性压电抑制剂GsMTx-4处理细胞,与对照相比,超声诱导的钙升高有边缘(不显著)抑制作用(图2E.).相反,TRP阻断剂钌红(1-10 μM)的处理部分抑制了钙信号(图2f.),而非选择性ASIC抑制剂阿米洛利则通过微管超声完全消除钙信号(图2G.).上述结果表明asic可能是微管超声机械转导的主要通道。为了缩小asic的候选范围,我们测试了ASIC1a抑制剂PcTx1 (50 nM)。PcTx1 (50 nM)显著抑制微管超声对钙离子的响应(图2h图2 -图补充4C).本文综述了上述通道阻滞剂的相对抑制作用图2I..我们进一步检测了PcTx1对微管超声的剂量依赖性抑制,并测定了IC50为0.2 nM,表明同源三聚体ASIC1a是作用中的机械受体(图3一图3 -图补充f).为了验证ASIC1a激活如何导致钙离子对超声的反应,我们用钙螯合剂乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N ',N ' -四乙酸(EGTA) (1-5 mM)处理细胞,以阻断细胞外钙离子。结果表明钙内流是绝对必要的(图3 b图3-figure补充1g- h).为了研究内质网钙是否参与钙信号传导,我们发现RyR抑制剂JTV519富马酸(10 μM) (图3-figure补充1g)被部分抑制,而作为IP3R抑制剂,( - ) - Xestonspongin C(1μm)最受抑制(图3 b).

ASIC1a作为一种机械感受器,对超声和声流结合的机械刺激作出反应。

一个) 700mVpp、DF20%微管超声诱导PcTx1钙反应3 s的剂量依赖性抑制曲线(n = 5) (B)晶须图显示ΔF/F峰的比较0在微管超声(700mVpp, DF20%, 3 s)刺激的3 - 5 s内,对照组(n = 16)、2-或5 mM egta处理的神经元(n = 6或4)、RyR抑制剂JTV519富马酸(10 μM)处理的神经元(n = 10)或IP3.R抑制剂(-)- xeston海绵蛋白C (1 μM)处理的神经元(n = 5)。学生t检验与p值比较,在胡须图上列出的对照。(C图显示肌动蛋白聚合抑制剂Cytochalasin D (5 - 10 μg/ml)处理的神经元(n = 7和n = 9)与未处理的对照组(n = 5)的钙反应(D)钙信号显示微管组装抑制剂诺考达唑(5-10 μg/ml)对神经元的影响(n = 8和n = 10)。(E)晶须图显示ΔF/F峰的比较0在3 - 5 s在微量吸液管超声(700 mvpp DF20% 3 s)刺激在治疗控制主要神经元(n = 11),细胞松弛素D 5或10μg / ml治疗神经元(分别为n = 7或n = 9),诺考达唑5或10μg / ml治疗神经元(分别为n = 8或n = 10)。单因素方差分析的统计p值列示治疗的显著性。(F)微管超声刺激下神经元胞体中ASIC1a的动画。绿色箭头表示声流的拉力,紫色箭头表示超声导致细胞骨架重排的压缩力。

ASIC1a力学反应需要细胞骨架动力学

以前的研究表明asic参与了系链模式的机械转导,这依赖于完整的细胞骨架结构(程等,2018Lin et al., 2009).我们同样用肌动蛋白聚合抑制剂,细胞松弛素D (5-10 μg/ml)或微管组装抑制剂,诺考达唑(5-10 μg/ml)处理细胞。事实上,细胞骨架动力学的抑制可以剂量依赖性地显著抑制微管超声刺激的钙反应(图3汉英).经过整理的数据揭示了一种新的超声机械转导模式,它结合了压缩力和剪切力,激活了小鼠神经元中的ASIC1a通道(图3 f).

在CHO细胞中过表达ASIC1a可加速超声刺激下的钙反应

接下来,我们区分了ASIC1a在异体表达系统中,在微管引导超声刺激下引起钙反应中的作用。我们转染Asic1cDNA(质粒特异性构建Asic1a在不含内源性ASIC1a的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中发现。用模拟转染试剂处理的细胞作为对照进行比较。有趣的是,CHO细胞可能含有一些内源性机械敏感机制,可以对微管引导的超声表现出延迟的钙反应(图4一图4 -图补充1A).相比之下,Asic1-转染的细胞对超声显示出立即的钙反应(图4 a - c视频5图4 -图补充1B),表明ASIC1a在超声介导的机械转导中发挥作用(图4 c).基于不同时间点的曲线(AUC)下的区域分析超声诱导的钙响应。双向ANOVA分析显示ASIC1A过表达和超声治疗显着调节CHO细胞的钙响应(补充文件1),二者交互作用的p值为0.086。钙离子的直接反应Asic1-转染的CHO细胞与在原代神经元中检测到的相似(视频2- - - - - -4).以0.01%皂苷细胞穿孔校正的钙离子响应可激增至Fura-2 (F340/380nm) (图4 -图1C, D).在0.01%皂素的情况下,2-way ANOVA分析表明,ASIC1a过表达对差异没有影响,差异不显著ppvalue (F= 0.11;P = 0.74) (补充文件1),而细胞穿孔显著促进了钙反应(F= 10.52;P < 0.0001) (补充文件1).注意PcTx1处理并不影响超声诱导的载体转染细胞的延迟钙反应(图4 e),而超声作为一个因素仍有显著的贡献(F= 17.2;P < 0.0001),而无显著差异(F= 1.44;P = 0.15) (补充文件1)药物治疗与超声刺激的相互作用(补充文件1).相比之下,PcTx1显著抑制超声诱导的钙反应Asic1转染细胞(图4 f) (F= 1.26;P = 0.29) (补充文件1),而这两个因素的交互作用显著(F= 4.46, p < 0.0001) (补充文件1).通过对CHO细胞裂解物的西方分析验证ASIC1a的过表达(图4 g).

在CHO细胞中,过表达ASIC1a在微管引导的超声刺激下表现出快速的钙反应。

一个) Invitrogen Fura-2, AM,细胞渗透(Fura-2)染色CHO细胞。呋喃-2在340 nm/380 nm (F340/380nm),并显示平均线形图。F340/380nm比例值绘制的时间显示在图4 -图补充1A,B.通过在时间点10s处的红色虚线表示超声刺激,持续3秒。蓝色虚线表示超声终止的时间。控制n = 18,ASIC1a过表达n = 15.(BF的曲线下面积(AUC)340/380nm以10秒的方式绘制。每个点代表一个被量化的细胞。三批实验用三种不同的颜色表示。指补充文件1对这张图进行双向方差分析。Control n = 14, ASIC1a过表达n = 15。(C)钙反应时间由最大F决定340/380nm与假转染对照组相比,超声刺激显著缩短。控制n = 18,ASIC1a过表达n = 15.(D)细胞穿孔处理0.1%皂苷在HHBS实验后进行内部校准的最大响应。指补充文件1对这张图进行双向方差分析。Control n = 7, ASIC1a过表达n = 7。(EPcTx1处理或不处理均可使CHO细胞钙离子反应。指补充文件1对这张图进行双向方差分析。Control n = 4, PcTx1 (2 nM) n = 5, (4 nM) n = 5, (10 nM) n = 5。(F) ASIC1a过表达的CHO细胞,无论PcTx1或不处理。指补充文件1对这张图进行双向方差分析。Control n = 5, PcTx1 (2 nM) n = 3, (4 nM) n = 3, (10 nM) n = 3。(GASIC1a的Western分析比较伪转染的对照和Asic1转染细胞。GAPDH检测作为内部控制。

视频5
微管引导超声诱导CHO细胞钙反应。

右图为过表达ASIC1a的CHO细胞,左图为转染伪对照细胞。在340 nm/380 nm (F340/380nm).其中红色代表最高比例,紫色代表最低比例的光谱彩色编码荧光比率340/380nm.当视频中出现微吸管尖端的虚线时,开启超声功能发生器。超声设置为600mVpp输入电压,占空比10%,持续3 s。这个设置同时产生了超声波和声学流效应。

经颅超声治疗促进牙齿过滤的神经发生

接下来,我们研究了在小鼠大脑中进行低强度超声刺激是否会对成年神经发生产生有利的结果。我们选择双皮质素(DCX)作为齿状回神经发生的标志物(Germain et al., 2013Jin等人,2010拉奥和谢蒂,2004年).与未处理的对照组相比,连续3天5分钟超声处理(5 mW/cm)2),第4天和第7天齿状回DCX染色显示显著增加2倍(图5).结果表明,低强度超声反复刺激小鼠大脑可实现有益的神经调节,导致齿状回神经发生。

重复经颅超声治疗诱发齿状回神经发生。

一个)用4 mW/cm超声连续治疗小鼠3天2在第4或第7天进行灌注固定,然后从头部解剖并切片进行免疫荧光检查。将实验组小鼠齿状回DCX染色与对照组比较。(B)与对照组、超声治疗后第4天和第7天比较,DAPI染色清晰的细胞核被DCX标记物包围。统计分析:单因素方差分析p = 0.0013, F比率= 15.18 (n = 4)。C, D)未处理小鼠的典型显微照片。齿状回振动器冠状脑切片(100 μm)免疫荧光染色显示DCX(绿色)和MAP2(红色)。蓝色表示DAPI染色细胞核。代表显微照片显示。(E, F第4天固定的超声治疗小鼠的典型显微照片。(G H第7天固定的超声治疗小鼠的典型显微照片。比例尺200 μm。

超声诱导DCX标记的神经发生部分受到抑制Asic1击倒(专为Asic1a替代拼接异构体)

我们在野生型和Asic1击倒(Asic1-/-超声(5 mW/cm)处理1 min,连续3天2),并在第7天处死小鼠,以量化超声对小鼠DCX染色的影响。我们观察到在超声治疗组中DCX染色的重复显著增加,而定量和学生t检验分析表明,在超声治疗组中,DCX染色的增加部分受到抑制Asic1-/-图6 -ⅰ).我们测试了这两个因素之间是否存在交互作用,即双向方差分析结果显示超声治疗(F= 9.4;P = 0.0098)Asic1-/-F= 26.35;p = 0.0002)在调节dcx阳性细胞计数(补充文件1).此外,没有显著的交互作用(F= 0.22;p = 0.65),而这两种因素对DCX细胞计数均有显著且独立的影响(补充文件1).

DCX染色阳性细胞增多,但部分受损Asic1-/-经过连续3天的超声治疗。

一个) 5周龄野生型假手术对照组小鼠齿状回(DG)的显微照片显示典型的DCX染色模式(绿色荧光)。(B)野生型DG中的放大的DCX阳性细胞。(C, D)连续3天超声治疗后,dcx阳性细胞明显增多。(E, F)假治疗的典型缝合显微照片Asic1-/-齿状回。(G H超声刺激下DCX染色的增加部分受到抑制Asic1-/-.()共聚焦显微镜扫描8-10 z平面叠片,定量分析100 μm脑切片中DCX细胞计数/mm, DCX和DAPI染色清晰。比例尺100 μm。分别有5周龄和7周龄的两批小鼠,所有z堆的细胞计数均基于包括两批小鼠的野生型对照组的平均值进行归一化。每个数据点表示对一只动物的量化;野生型对照n = 4,野生型超声治疗n = 5,Asic1-/-控制n = 3,Asic1-/-超声刺激n = 4。指补充文件1对这张图进行双向方差分析。

Asic1-/-抑制经颅超声诱导小鼠脑中的P-ERK

为了研究ASIC1a是否也对小鼠大脑中的p-ERK反应负责,我们使用了Asic1-/-Asic3-/-在振动器脑片p-ERK染色实验中。的包容Asic3-/-ASIC3在体感神经元、三叉神经节神经元和螺旋神经节神经元中高表达,阐明了周围神经在大脑激活中的作用。与模拟控件(图7A, H和O),经颅超声刺激野生型小鼠p-ERK细胞计数(图7B、I和P)显著增加(图7).与模拟控件(图7C, J和Q), p-ERK染色细胞计数增加Asic1-/-海马区部分减少,而皮质区和杏仁核区则显著减少(图7D, K和R).p-ERK细胞计数的减少导致模拟对照与超声刺激之间的差异无统计学意义Asic1-/-老鼠(图7G, N和U).另一方面,Asic3-/-小鼠在模拟对照中表现出更一致的低背景p-ERK (图7E, L和S), p-ERK细胞计数显著增加(图7F, M和T)到超声处理。定量对小鼠的这三种基因型中的P-ERK反应使我们得出结论,ASIC1A在介导小鼠脑中的经颅超声刺激方面发挥着重要作用。P-ERK细胞计数的双向ANOVA分析表明,在皮层中只有两个因素,即基因型和超声处理的相互作用(F= 6.45, p = 0.0037),但在海马和杏仁核中不存在(补充文件1).为了测试周围神经是否在介导超声刺激中有作用,我们纳入了Asic3-/-在我们的p-ERK反应表型研究中,基因型并没有减少p-ERK的激活Asic1-/-所做的。这些结果表明,小鼠大脑中的p-ERK反应可能是由经颅超声直接引起的,而不是由连接听觉回路或其他感觉回路的神经元所引起的继发效应引起的,因为ASIC3主要表达于体感觉神经元和螺旋神经节神经元(Lin et al., 2016Wu et al., 2009).

Asic1-/-抑制小鼠大脑皮层、海马和杏仁核p-ERK细胞数量的增加。

免疫组化染色野生型小鼠的大脑切片,Asic1-/-老鼠和Asic3-/-老鼠。所有基因型小鼠随机分为假手术组和超声治疗组。使用ImageJ对p- erk阳性细胞进行定量,设置阈值和代表实际染色模式的颗粒大小。(f)振动器脑切片皮层p-ERK IHC染色的显微照片。(G定量比较三种不同基因型小鼠的皮质p- erk阳性细胞,无论是模拟处理还是超声刺激。()免疫组化显微镜显示海马p-ERK染色。(N)定量比较小鼠海马p- erk阳性细胞的基因型和治疗。(到水果)免疫组化显微镜显示杏仁核p-ERK染色。(U)杏仁核p- erk阳性细胞的定量比较。比例尺100 μm。每个数据点代表一个小鼠大脑的细胞总数;野生型对照n = 11,野生型超声治疗n = 10,Asic1-/-控制n = 5,Asic1-/-超声刺激的n = 9,Asic3-/-控制n = 5,Asic3-/-超声刺激n = 5。指补充文件1对这张图进行双向方差分析。

为了进一步解决在超声刺激时显示P-ERK响应的细胞类型,我们进行了几种标记的免疫荧光共染力,例如Neun,NMDAR,GAD67和PV。有一个明显的P-ERK与Neun共染色(94%或197/209)然而,这些细胞不是NMDAR阳性(图7 -图补充).另一方面,与神经元间标记物GAD67共染的群体非常小(4.5%或10/223),与PV共染的群体更小(0.9%或2/211)。免疫组化或IF染色的asic1a特异性抗体将阐明p- erk反应细胞是否为asic1a阳性神经元。然而,需要进一步的研究来全面了解特定于超声激活反应的细胞类型。

讨论

越来越多的证据表明asic涉及感觉神经系统中不同类型的机械转导,包括痛觉、压力感受、本体感觉和听觉(程等,2018Lin et al., 2016Chen and Wong, 2013).尽管ASIC1a是一种主要的酸传感器,在生理和病理条件下调节神经活动,但ASIC1a在大脑中的机械敏感作用尚不清楚(巴伦和Lingueglia, 2015Wemmie等人。,2013年).在这里,我们证明了低强度超声可以调节小鼠大脑的神经活动,并直接激活神经元(图1),通过依赖asic1a的方式(图2- - - - - -3.).而目前经颅超声激活大脑神经元的观点是通过听神经(佐藤等人,2018年,我们的结果来自Asic3-/-提示外周神经可能在低强度超声激活小鼠大脑p-ERK过程中不起作用。另外,低强度超声介导的机械转导可能通过特定于ASIC1a的通道亚型方式起作用,但对其他ASIC亚型不起作用,如葡萄糖促治疗(Han等人,2021年).此外,反复经颅低强度超声刺激是安全的,能够诱发小鼠大脑的成年神经发生(图4).

虽然ASIC1a被确定为参与低强度超声机械转导的分子决定因素,非选择性机械传感器抑制剂,如钆和钌红,部分抑制由微管超声触发的钙反应(图2G和H).值得注意的是,钆也阻挡了μM到mM范围内的asic。然而,我们不能排除TRP通道在微管超声机械转导中的作用,因为没有证据表明钌红也能抑制asic。以往的研究已经提出TRP在超声介导的机械转导中的作用,而采用的是高强度超声。TRP在低强度超声机械转导中的作用,以及钌红在神经元ASIC1a信号通路中的意外作用还需要更多的研究。

ASIC1a在大脑中广泛表达,可形成同源三聚体和异源三聚体通道,对PcTx1抑制的敏感性不同(Joeres等人,2016年Sherwood等人,2011年).具体来说,异三聚体ASIC2b/ASIC1a可被约3 nM (Sherwood等人,2011年PcTx1和ASIC1a/ASIC2a异质三聚体可被50 nM抑制(Joeres等人,2016年),而0.5nm至1nm可以抑制同型ASIC1a(Escoubas等人,2003年Saez等人,2011年).因此,由于小剂量PcTx1通过微管超声有效抑制ASIC1a介导的钙信号,同三聚体ASIC1a通道可能是参与皮质神经元超声机械转导的主要亚型(图3一图3 -图补充).

为了解释超声诱导ASIC1a机械转导的模式,我们假设微管超声在细胞水平上的物理效应;其中,声流对细胞根尖表面施加剪应力,而超声对整个细胞施加压应力。考虑体外组合力模式,我们认为,在混合加载条件下(图2 b3.F), ASIC1a的胞外结构域在剪切力的作用下将蛋白质拉向流动方向,而ASIC1a的胞内结构域与皮层肌动蛋白或其他细胞骨架相连,在超声反应下经历动态重组并耦合膜剥离(Chu et al., 2019Lim et al., 2020).因此,机械信号触发ASIC1a,本质上是一个钠通道,可能通过激活电压门控钙通道(Boillat et al., 2014).

另一方面,体内的条件(图3 -图补充),则不同。神经元嵌于细胞外基质(土黄色),如大脑中的层粘连蛋白、多赖氨酸或多鸟氨酸。ASIC1a在N366和N393处进行n -糖基化,这两个残基位于细胞外(静等,2012).而据报道,n -糖基化参与了ASIC1的表面转运和树突脊柱转运(静等,2012Kadurin等人,2008年),许多蛋白质的n -糖基化对粘附和迁移起着重要作用(顾,2012Medina-Cano等人,2018年史蒂文斯和斯潘,2017年),暗示N-聚糖的细胞外基质相互作用性质。当超声波施加到大脑时,通过细胞外基质施加的声压可以通过细胞骨骼依赖性方式激活ASIC1a(图3 -图补充),以及其他机械感应装置,如PIEZO及TRPV4 (Poole等人,2014Servin-Vences等人,2017年),因为这些机械感受器都已被证明是由底物压痕触发的。因此,这导致了表现为ERK磷酸化的细胞活化。

由于DCX已被公认为齿状回神经发生的替代标记(Jin等人,2010Salvi等人,2016年),连续3天超声治疗后齿状回dcx阳性细胞增多提示有治疗意义。值得注意的是,DCX在大脑发育中发挥多种作用,包括海马锥体神经元分层、皮质神经元迁移和轴突布线(Germain et al., 2013小泉等,2006).在发育中的大脑中使用超声波应极其谨慎。

总之,我们提供的证据表明,临床安全的低强度经颅超声可以调节小鼠大脑的神经元活动。低强度超声可通过ASIC1a直接激活神经元,为未来超声神经调节的发展提供了分子基础。

材料和方法

超声装置及刺激参数

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在我们的研究中使用了两种不同的超声波装置。我们使用了商用的1MHz传感器(C539-SM, Olympus, Tokyo, Japan)在活体实验中刺激小鼠大脑(图1一个).用微管超声模拟钙成像(Chu等人,2021年)连接一个1MHz传感器(直径15毫米)。超声钙成像实验装置的原理图如图所示图2A.所有的传感器都由一个功能发生器(Tektronix AFG1022, Beaverton, OR, USA)通过一个功率放大器(E&I 210 L, Rochester, NY, USA)控制。在体内刺激时,输入电压为900 mVpp,占空因数为1%,脉冲频率为1 kHz。我们使用浸在水中的水听器(HGL-1000, Onda, Sunnyvale, CA, US)描述了细胞暴露在超声波下的特征。用于体内动物实验的强度为5 mW/cm2(我SPTA), 7.4 mW/cm2(我SPPA, 700mvpp)用于微管体外实验。这些强度值在超声波不会引起任何副作用的范围内,比如发热和空化。

探索上游机械感受器需要钙成像分析,可以重复和可靠地响应超声刺激,以便抑制剂的效果可以清楚地证明。微管超声提供了广泛的可控性。为了选择合适的钙实验参数,我们测试了两种极端条件:一种是高输入电压和低占空比(1500 mVpp, 0.05%占空比)超声刺激,另一种是低输入电压(100 mVpp)和连续波超声刺激。作为一种主要的超声刺激,微管超声表现出点源特征(图2 -图补充1A).作为一种主要的流动刺激,微管超声产生一种向内流动模式(图2 -图补充1B).

调整微管的位置以刺激神经元,如图(图2 -图补充1C).从微管尖端到细胞顶膜的距离大致控制在20 μm (图2 -图补充1D).

动物

所有动物程序均符合台湾台北市中央研究院动物保育及使用委员会的指导方针。/ Asic1−−小鼠为台湾NYCU的CC Lien博士的礼物,通过杂交产生Asic1条件Ko(Asic1F / F.)小鼠(吴,2013),用精蛋白cre小鼠(Lin et al., 2015).Asic3基因敲除/eGFP-f老鼠兄弟(Asic3-/-)是基于Accn3基因;简而言之,设计主要是6 KB长臂的靶向等位基因(cII∼cII DNA片段位于转录起始位点下游82 bp)和ATG翻译起始位点上游240 bp短臂Accn3用于同源重组(Lin et al., 2016).野生型或Asic1-/-Asic3-/-超声刺激前一天,异氟醚麻醉下对6-8周C57B6/J小鼠刮刀。将小鼠随机分为两组,一组将超声换能器置于头顶进行假手术治疗,另一组在异氟醚麻醉下超声刺激小鼠大脑1分钟,以评估超声刺激后小鼠大脑中的神经元活动。给药后立即用氨基甲酸乙酯(1.5 g/kg;经心脏灌注25 ml 0.02 M Tris缓冲生理盐水(1 x TBS, pH7.4, 4°C),然后25 ml冷固定剂(4%[w/v]甲醛,0.02 M TBS (pH7.4, 4°C))。

脑组织组织学及免疫组化

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解剖小鼠脑,4%甲醛4°C固定16小时;用Vibratome 1000 Plus (Rankin Biomedical, Holly, MI)切片,厚度100 μm,用抗体自由漂浮法孵育。abc - dab -镍染色,组织切片首先在含0.03% H的1 × TBS中漂白2O2然后用含有5%牛血清白蛋白(BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和5%正常山羊血清(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA)的TBST (TBS +0.05% Triton X-100)在室温下阻断60分钟,并与Rabbit polyclonal Phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (Thr202/Tyr204)一抗[(1:500)#9101,Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA]在4°C封闭溶液中稀释过夜。切片用TBST洗三次,用二级生物素化山羊抗兔抗体(1:1000,Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)在室温下孵育1小时。三次TBST洗涤后,切片在Avidin-Biotin预混合溶液中孵育(1:200,Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)。经过3次1xTBS洗涤后,使用镍-DAB方法观察阳性免疫反应信号[DAB过氧化物酶(HRP)底物试剂盒(含镍),3,3 ' -二氨基联苯胺SK-4100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA或Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA]。

主细胞培养

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为保证神经元特异性p-ERK的检测,我们建立了新生小鼠脑原代培养物。简单地说,用Castroviejo剪机械切碎新生小鼠大脑皮质,用胰蛋白酶(SI-T4174-100ml, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)与l -谷氨酰胺(2 mM/ml) (SI-G7513-100ml,在脱氧核糖核酸酶I (SI-D4513-1vl, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)处理前,在37°C下进行15分钟的HBSS清洗(SI-D4513-1vl, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)。处理后的组织用火抛光玻璃移液管研磨,并通过40 μm过滤器(431750,Corning Inc, Corning, NY, USA)进行过滤,然后在等离子处理和多聚d -赖氨酸(SI-P7405 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)涂层玻璃盖玻片上种子,密度为105/ml添加B27+ (Gibco A3582801, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)神经基质(Gibco A3582901, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)与10%马血清(Gibco 26050070, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)和青霉素/链霉素(100 U/ml) (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)。培养逐渐被无血清B27+神经基础培养基取代,直到第7天进行免疫荧光或活细胞钙信号检测。

活细胞钙信号成像

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为了观察神经元神经突和细胞体中的钙信号,我们用三种不同的绿色荧光染料处理原代培养物,即Invitrogen Oregon green 488 bappa -1, AM cell permeant (O6807, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), Invitrogen FluoroPure grade (F23917, MA, MA),或Invitrogen Fura-2, AM,细胞渗透(1mm溶液在无水DMSO) (F1225,赛莫Fisher Scientific Waltham, MA,美国)。盖片上活原代培养物浸泡在HHBS (20 mM Hepes pH7.4, 1 mM CaCl)中2, 0.5 mM氯化镁20.4 mM MgSO47小时2O, 5 mM KCl, 0.4 mM KH2阿宝4, 4 mM NaHCO3., 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO46 mM d -葡萄糖),2-5 μM荧光染料,孵育90 min。随后用含17%神经基基质的HHBS替代钙染色液。将盖玻片固定在成像室上,置于荧光显微镜下,将微管超声设置在目标细胞附近。

使用Olympus IX71荧光显微镜(Olympus Corporation,Shinjuku,Tokyo,Japan)记录图像,用于显微镜摄像机附件,具有0.63 x镜头(DP80,Olympus Corporation,Shinjuku,Tokyo,Japan)。在imagej中分析了堆叠的图像。确定神经菌素或细胞体的ROI用于重组以获得绘制时间点的荧光强度数据。

分子信号蛋白抑制剂

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为了确定是PIEZO受体还是TRPC1对信号负责,我们应用GsMTx-4 (500 nM) (Bae等人,2011年鲍曼等人,2007年) (ab141871, Abcam Inc, Cambridge, MA, USA)从狼蛛毒液和钆(10 μM) (costet al., 2010) (G7532, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)对组织或细胞进行超声治疗。为了研究ASIC通道在超声信号转导中的潜在作用,我们使用了抑制剂,如阿米洛利(100 μM) (冷等,2016) (A7410-1G Sigma-Aldrich,圣路易斯,MO, USA)和PcTx1 (0.1-50 nM) (Cristofori-Armstrong等人,2019年) (Tocris #5042, Bio-Techne Corporation, Minneapolis, MN, USA)。为了检测内质网储存钙是否参与钙信号的检测,RyR抑制剂JTV519富马酸(10 μM) (亨特等人,2007年)和Thapsigargin (T9033, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)。

DCX免疫荧光染色

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VLIUS刺激后处死小鼠,灌注10%甲醛/PBS。然后收集大脑,用10%甲醛/PBS在室温下固定。样品被石蜡包埋,7 μm的横切面被固定在载玻片上。样品经脱蜡、复水、抗原回收(100℃,20 min)、PBST洗涤。切片用10%新生牛犊血清(NCS)和1%牛血清在PBST中阻断1小时,一抗在4℃过夜。用PBST洗涤后,在室温下与二抗孵育1小时,用PBST洗涤,用EverBrite Hardset Mounting Medium containing DAPI标记细胞核(Biotium)。观察载玻片,并用LSM780共聚焦显微镜(蔡司,耶拿,德国)拍摄图像。免疫染色用一抗及其稀释倍数分别为兔抗dcx (1:200, Cell signaling)和小鼠抗map2 (1:200, Thermo)。使用Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG (1:100, Thermo)和Alexa Fluor 555标记山羊抗小鼠IgG (1:100, Thermo)作为二抗。

数据及统计分析

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使用ImageJ对细胞进行计数。使用分水岭分割的全局阈值对细胞进行识别。像素组的数量被计算为细胞的数量。细胞也从亮场图像中手工计数。使用学生t检验比较对照组和超声组的测量值。p值≤0.05为有统计学意义。所有动物实验的统计分析均使用GraphPad Prism 8进行。

附录1

附录1 -关键资源表
试剂类型(种类)或资源 指定 源或引用 身份标识 额外的信息
其他 野生型C57BL/6 J (亩骶 杰克逊实验室 物料编号:000664 中国科学院生物医学研究所实验动物实验室12-03-332,20-06-1492
其他 Asic1a-/-(特异性靶向选择性剪接亚型Asic1a-/-) C57BL6 / J (亩骶 Eur J Neurosci 2015年6月;41(12): 1553 - 68。doi:10.1111 / ejn.12905 Asic1-/- 中国科学院生物医学研究所实验动物实验室12-03-332,20-06-1492
其他 Asic3-/-C57BL6 / J (亩骶 2016年5月;7:11,460。doi:10.1038 / ncomms11460 Asic3-/- 中国科学院生物医学研究所实验动物实验室12-03-332,20-06-1492
细胞系(Cricetulus将 像中国仓鼠卵巢细胞一样上皮 写明ATCC ccl - 61 (RRID:CVCL_0214
转染构造(Discosoma sp.) pCMV——mCherry 台湾中央研究院IBMS黄宜水博士的礼物 病媒控制 1 μg DNA: 3 μl Lipofectamin 2000,置于1ml最佳- mem培养基中
转染构造(亩骶 PT7-RFP-N2-T▲T - P2A - MASIC1A(替代拼接同种型Asic1a 小鼠ASIC1a的cDNA亚克隆到质粒(pT7-RFP-N2)中 Asic1 1 μg DNA: 3 μl Lipofectamin 2000,置于1ml最佳- mem培养基中
抗体 活跃;兔多克隆[polyclonal Phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (Thr202/Tyr204)] 细胞信号技术 # 9101 (RRID:AB_331646 包含IHC (1:50 0)
抗体 Doublecortin;(兔多克隆) 细胞信号传导 # 4604 (RRID:AB_561007 国际刑事法庭(1:200)
抗体 MAP2;(鼠标单克隆) 热费希尔科学 ma5 - 12823 (RRID:AB_10982160 国际刑事法庭(1:200)
抗体 二级生物素化山羊抗兔抗体;(山羊单克隆) 向量的实验室 ba - 1000 - 1.5 (RRID:AB_2313606. (1:1000)
抗体 Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG;(山羊单克隆) 热费希尔科学 16 - 237 (RRID:AB_436053 (1:10 0)
抗体 Alexa Fluor 555标记山羊抗小鼠IgG;(山羊单克隆) 热费希尔科学 A-21422(RRID:AB_141822 (1:10 0)
商业测定试剂盒 包含IHC试剂;Avidin-Biotin预混的解决方案 向量的实验室 a - 2004 - 5 (RRID:AB_2336507. (1:200)
商业测定试剂盒 包含IHC染色设备;DAB过氧化物酶底物试剂盒与镍,3,3 ' -二氨基联苯胺 向量的实验室 sk - 4100 (RRID:AB_2336382 根据使用说明书
商业测定试剂盒 活细胞显像染色剂;Invitrogen Oregon Green 488 bappa -1, AM,细胞渗透 热费希尔科学 O6807 5μM
商业测定试剂盒 活细胞显像染色剂;Invitrogen flu4, AM, FluoroPure 热费希尔科学 F23917 5μM
商业测定试剂盒 活细胞显像染色剂;呋喃-2,AM,细胞渗透 热费希尔科学 F1221 5μM
化合物、药物 GsMTx-4 Abcam公司 ab141871 500海里
化合物、药物 阿米洛利 Sigma-Aldrich A7410-1G 100μM
化合物、药物 PcTx1 Tocris # 5042 0.1 -50海里
化合物、药物 Ruthenium Red. Tocris # 1439 5 - 10μM
化合物、药物 RyR抑制剂,JTV519富马酸盐 Tocris # 4564 10μM
化合物、药物 Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 100海里
化合物、药物 细胞松弛素D Tocris # 1233 5 μg- 10 μg/ml
化合物、药物 诺考达唑 Tocris # 1228 5 μg- 10 μg/ml
软件、算法 图像J Magalhaes,艾布拉姆,m D p . J。& Ram, s . J .(2004)。使用ImageJ进行图像处理。Biophotonics国际11(7) 36-42。 粒子分析 设置阈值并定义颗粒大小
软件、算法 GraphPad棱镜8 斯威夫特(1997)。GraphPad棱镜,数据分析,科学绘图。化学信息与计算机科学杂志37(2), 411 - 412。 学生的学习任务

数据可用性

所有与本研究相关的数据都包含在手稿中,并以主要图形或图形补充的形式呈现在手稿中。源数据文件将在需要时提供。

参考文献

决定信

  1. 罗西尼库恩
    检查编辑器;德国海德堡大学
  2. 安德鲁J王
    高级编辑;英国牛津大学

为了提高透明度,eLife会发布最实质性的修订请求以及相应的作者回复。

验收摘要:

本研究报告了机械力敏感三聚阳离子通道ASIC1在超声刺激小鼠大脑神经元激活中的新作用。

决定函同行评审后:

感谢您提交的文章“ASIC1a是通过低强度超声刺激小鼠大脑神经元激活所必需的”el.您的文章已由两名同行审稿人审阅,评估由一名审稿人和资深编辑Andrew King监督。审查人员选择匿名。

审稿人相互讨论了这些评论,审稿人起草了这个决定,以帮助您准备修改后的提交。

随着编辑认为你的手稿感兴趣的,但如下所述,需要额外的实验之前,可以考虑进一步的出版,我们想吸引你的注意力的变化我们修订政策,我们在应对COVID-19 (//www.tattooswelt.com/articles/57162)。首先,由于许多研究人员暂时无法进入实验室,我们会给作者足够的时间提交修改后的稿件。我们还提供,如果你选择,将手稿发布到bioRxiv(如果它还没有在那里)连同这个决定信和正式的指定,手稿是“在修订中el".请让我们知道,如果你想追求这个选择。(如果你的作品更适合medRxiv,你需要自己发布预印本,因为我们这样做的机制仍在开发中。)

简介:

这是一份有趣的手稿,表明超声波刺激诱导细胞外基质和细胞骨架的运动,从而导致皮质神经元中ASIC1a的机械激活。这是一个新的发现。

必要的修正:

审稿人认为这项研究的结果很有趣,但也表达了对开放性问题和方法论问题的主要关注。最重要的是,评审者认为没有足够的证据支持ASIC1a在超声刺激反应中的关键作用。

订正本将需要解决并包括下列问题:

1.ASIC1a介导了体内和体外实验中描述的效果,支持这一说法至关重要。对于超声刺激pERK激活的体内实验,应选用合适的ASIC敲除小鼠。这个实验对于进一步考虑重新审查手稿是至关重要的。在HEK细胞的体外实验中,审核员希望看到ASIC1a转染和测试,以确定这是否足以赋予超声刺激的敏感性。

2.钙想象的实验:在钙成像实验中测试的细胞数量必须在图例中规定,应该澄清数据点是否指的是单个单元或均值,并且足以用于稳健的解释。关于内部校准和细胞响应完整性的数据,例如使用离子载体,应显示。如果抑制剂从相同的面板或不同的细胞施加对照细胞,则应澄清抑制剂。请说明实际响应超声刺激的控制单元。

[编者注:在接受之前建议进一步修订,如下所述。]

感谢您提交的文章“ASIC1a是通过低强度超声刺激小鼠大脑神经元激活所必需的”el.您的文章已由一位同行审稿人审阅,评估工作由一位评论编辑和资深编辑Andrew King监督。以下参与审阅您的投稿的个人已同意透露他们的身份:Gary R Lewin(审稿人#3)。

审稿人已经互相讨论了他们的评论,审稿人已经起草了这篇文章来帮助你准备修改后的提交。

必要的修正:

1.修改文本,以避免任何声称ASIC1通道的激活足以通过超声波刺激神经元的激活,并且这必然与通道的机械激活有关。请讨论ASIC3可能导致这种效果的替代方案。

2.纠正ASIC1是通过系绳门控的断言。

3.确保所有图像和显微照片都有比例尺。

评论家# 3:

作者做出了很大的努力,在手稿中添加了新的数据。最值得注意的是对ASIC1和ASIC3敲除小鼠模型中超声诱导的神经元激活(pERK作为替代)的新分析。作者注意到ASIC1-/-小鼠中pERK阳性细胞的基线数量较高,但超声暴露后未见增加。这一数据与ASIC3突变小鼠的数据相结合,ASIC3突变小鼠的超声效应没有衰减,更好地支持了ASIC1在超声效应中的作用。作者仍然应该注意到,这些数据暗示ASIC1在这种效应中发挥了必要的作用,但并没有表明这种三聚体通道的机械激活是体内效应的机制。例如,ASIC1的存在可能对该效应所必需的其他蛋白质的贩运或功能是必要的。事实上,作者至少应该在讨论中对ASIC1a对钠离子具有高度选择性这一事实进行评论,这一事实不能直接解释体外实验中测量到的钙内流。

作者们应该注意的另一个普遍观点是,他们断言ASIC1a是通过系绳门控的。据我所知,目前还没有直接的证据表明有一种分子链可以与这种蛋白质结合,从而控制通道。相反,这个断言是基于对衬底压痕可以激活这样一个通道的观察(来自Chen实验室的工作)。然而,PIEZO和TRPV4通道也显示了这一点。这些数据在PMID: 24981693进行了简短回顾。

https://doi.org/10.7554/eLife.61660.sa1

作者的反应

评论家# 1:

在题为“ASIC1a是通过低强度超声刺激小鼠大脑神经元激活所必需的”的论文中,Lim等人研究了经颅低强度超声刺激大脑神经元激活的机制。作者认为,超声刺激诱导的细胞外基质和细胞骨架运动导致皮层神经元中ASIC1a的机械激活,从而导致ca2+pERK的内流和随后的表达,作者使用它作为神经元激活的替代标记。

虽然我同意通过激活机械敏感离子通道激活超声激活神经元的发现是非常有趣,但我必须说在我看来,实际数据不支持大部分结论和声明。

1.整个研究是完全相关的。因此,作者进行了两个独立的实验;一方面,体内经颅超声刺激可诱导不同脑区pERK,另一方面,超声诱发ca2+皮层神经元的内流可能是由ASIC1a介导的。从这些数据中,他们得出结论,pERK激活也由ASIC1a激活介导。然而,这纯粹是猜测。提交人必须提供额外的证据来支持他们的主张。在我看来,仅仅使用PcTx1是不足以证明ca2+信号由ASIC1a介导。因此,作者首先应该证明ASIC1a确实是被超声激活的。这是一个非常简单的实验。他们所要做的就是在细胞系(如HEK293, CHO等)中表达ASIC1a,并证明这种表达使细胞对超声波敏感。第二,如果作者能首先证明皮质神经元,特别是那些表现pERK激活的神经元,表达ASIC1a,我将不胜感激。这也相当简单——只是用抗asic1a抗体对大脑切片进行联合染色。第三,如果作者想坚持他们的主张(见标题),即超声激活大脑神经元需要ASIC1a,他们应该在ASIC1a敲除小鼠中检测超声诱导的pERK激活。

我们已经完成了Asic1a审稿人建议使用CHO细胞进行过表达实验。由于HEK293中内源性ASIC1a表达水平,CHO细胞比HEK293更有利。结果被组织成手稿图4。(除另有说明外,所有数字均按原稿数字编号系统引用)。基本上,我们的结果证实了ASIC1a介导神经元钙反应的概念。移液管对CHO细胞钙离子的反应有10-15秒的时间延迟(图4)一个B).我们认为这可能是由于声流,但延迟响应不在我们的研究范围内。CHO细胞过表达Asic1a显示超声对钙离子的即时反应(图4)一个B)与原代培养神经元(稿件图2)中检测到的相当。为了确保差异不是由于对细胞中的异位DNA引入异位DNA的影响,使用载体转染对照进行相同的实验来比较Asic1a转染细胞。我们观察并证实,超声刺激反应时间缩短是由于ASIC1a异位所致(图4)C).响应时间明显缩短Asic1a过表达CHO细胞(图4)C).刺激后,通过0.1%皂苷处理可再次提高细胞内钙,使细胞渗透(图4)D).以0.01%皂苷细胞穿孔校正的钙离子响应可激增至Fura-2的最大比值(F340/380nm)(图4 -图补充1C, D).对这组数据进行2-way ANOVA分析,ASIC1a过表达对差异没有影响,差异不显著p值(F = 0.11;p=0.74)(图4-表补充2),而细胞穿孔显著促进了钙反应(F=10.52;p<0.0001)(图4-表补充2)。注意,在载体转染细胞中PcTx1处理下,超声处理后的钙反应仍然有效(图4)E)由于钙的变化,钙的变化仍然是显着的(f = 17.2; p <0.0001)的超声,而药物治疗的有显着相互作用(f = 1.44; p = 0.15)超声刺激(图4表补充3)。相反,当CHO细胞过表达ASIC1A时,超声刺激对PCTX1抑制下的钙响应没有显着影响(图4F)(f = 1.26; p = 0.29)(图4-table补充4),而两个因素显着相互作用(f = 4.46,p <0.0001)(图4-table补充4)。简而言之,不同于PCTX1的失败抑制对照控制(图4E), ASIC1a介导的超声钙反应被PcTx1明显阻断,从稀释为2nM开始(图4)F).

审稿人要求对皮层神经元中ASIC1a表达进行免疫染色。然而,由于缺乏可靠的抗体,目前还无法对ASIC1a进行免疫染色。我们已经尝试了许多商业上可用的抗体Asic1a-/-然而,为了验证特异性,我们还没有发现能检测敲除样本中缺失的特异性信号的抗体。

尽管ASIC1a的共染色是不可能的,因为没有好的和特异性抗体可以满足敲除验证的标准。尽管如此,我们还是取得了三批Asic1a-/-小鼠,进行pERK免疫组化染色。结果证实Asic1a图7,表明ASIC1a是超声激活小鼠大脑细胞所必需的。p-ERK细胞计数的双向方差分析分析表明,只有两个因素的交互作用,即基因型和超声治疗大脑皮层(F = 6.45, p = 0.0037),但不是在海马和杏仁核(图7-table补充1)。为了进一步确认ASIC1a特定功能的调节超声波刺激,我们包括了Asic3-/-在我们的p-ERK反应表型研究中,基因型并没有减少p-ERK的激活Asic1a-/-所做的。这些结果表明p-ERK响应在老鼠大脑可能直接引起的继发效应引起的经颅超声,而不是由于听觉神经元连接电路或其他感官电路,ASIC3是主要表现在躯体感觉神经元和螺旋神经节神经元(1、2)。

2.评估ca是很困难的2+成像实验,因为这种方法,尤其是超声刺激,并没有很好的描述。因此,我不清楚超声波刺激器放置在离细胞多近的地方。此外,ca的n个编号2+成像实验是相当小的(顺便说一下,如果在图中有n个数字,阅读起来会容易得多)。最重要的是,尚不清楚抑制剂(钆,GsMTx4等-图2B-H)是应用于同一组的对照细胞还是应用于不同的细胞。在这种情况下,了解有多少控制细胞对超声波刺激做出反应是很重要的。考虑到低的n -数,我想知道作者可能很难找到有反应的细胞,这就是为什么n -数这么小的原因?我建议检查更多的控制神经元,并提供有关作出反应的细胞比例的信息。如果只对对照组和处理过各种通道抑制剂的细胞。

解决对ca有效性的关注2+为了更好的评价钙的反应,我们再次使用Fura-2染色试剂进行了实验,并设置了记录F的成像系统340/380nm图片。结果显示在(图2 - 数字补充2和视频)。

同样的细胞被第二次刺激,在超声刺激持续时间内仍然显示良好的反应(图2 -图补充2)。这可能是由于我们实验室的成像系统,光衰减问题相当严重,我们很难在以后的治疗中继续记录相同的视野。因此,尽管抑制剂被应用于同一盘子,不同的视野被记录,以定量钙反应。我们手稿中呈现的n -数字代表了我们测试的一个子集,主要来自使用Invitrogen Oregon Green 488 BAPTA-1, AM, cell permeant的实验。本项目于2019年获得资助时,我们实验室还没有Fura-2染色方法和成像系统。当我们使用Oregon Green 488 BAPTA-1时,几乎所有的测试视野(>90%)都对超声刺激有反应。因此,这使得量化具有更好的一致性。另一方面,如果使用Invitrogen Fluo-4, AM, FluoroPure,只有28.6%-38.5%的测试视野在超声刺激下显示钙反应(视频4)。当采用这种染色方法时,每次处理都使用新鲜的细胞培养皿。在图像记录后,我们从每个实验组中选择反应最好的细胞与假处理的对照组细胞培养皿进行比较。每个图和图表的n个数字被添加到手稿图形图例中。

图2 -图补充1C为微管在视频3视野中的位置。

评论家# 2:

在这项研究中,作者声称,短时间持续的低强度超声波刺激激活了整个大脑中的许多神经元。他们进一步声称,激活机制是通过ASIC1a通道。在这篇论文中有一些有趣的结果,但也有许多悬而未决的问题和方法论问题需要解决。作者使用pERK作为整体超声波刺激下的神经元激活的替代品。有些但不是所有的皮质神经元似乎显示激活(似乎只有大锥体细胞,为什么不是中间神经元?这里需要更多的分析)。

我们尝试用NeuN、NMDAR、GAD67和PV等多种标记物共染色来鉴定p-ERK细胞。结果如下图7 -图1所示。我们观察到大量p-ERK与NeuN共染色(94%或197/209)。但在我们的实验中未发现NMDAR共染的细胞。我们警告说,这可能是一个假阴性结果,这可能是由于抗体特异性和染色程序的限制。我们发现,与GAD67共染色的p-ERK阳性细胞数量很少(4.5%或10/223),而与Parvalbumin (PV)共染色的p-ERK阳性细胞比例更小(0.9%或2/211)。

这个实验之后是一个体外培养的新生儿皮质神经元的实验(据我所知,在这个实验中使用的动物没有年龄)。这些也不等同于在体内实验中测试的成体细胞。在大量的实验中,钙成像被用作测量神经元激活的替代品。不幸的是,在Δ F/Fo显示的图表中,没有任何显示所选择和测量的单元格数量的迹象。这对于评估结果的稳健性至关重要。此外,在实验结束时,使用离子载体使神经元向钙离子渗透是正常的。这使得当细胞外钙浓度与细胞内钙浓度平衡时,可以评估最大荧光信号。这是没有做的,这意味着实验没有内部校准。

神经元培养采用出生后3 ~ 5天的幼犬。新生儿原代培养的使用是为了证明超声波可以在简化的体外系统中直接激活神经元。值得注意的是,培养成人皮质神经元用于钙成像研究几乎是不可能的。为了确保结果的可重复性和稳定性,我们使用了四种不同的染色试剂;即(1)Invitrogen Oregon Green 488 bappa -1, AM, cell permeant, (2) Invitrogen Fluo-4, AM, FluoroPure, (3) Rhod-2 AM, fluorescent ca2+(4) Fura-2, AM, cell permeant。我们发现Rhod-2 AM与我们的系统不兼容,我们无法从染色中获得良好的信号。因此排除了这种染色方法。我们的观察结果可以用其他三种试剂再现。仅在应用Fluo-4时,反应神经元约为28.6% ~ 38.5%(6/21和10/26,共46个细胞)。

我们添加了0.1%的皂苷来显示最大荧光信号的评估。代表性结果如图4 -图1所示。

同样的,类似细胞穿孔试验使用俄勒冈州执行绿色488 BAPTA-1主要神经元钙响应提出了DF /最大F0(图2-figure补充3)。我们还测量了重复刺激相同的细胞使用此染色法和第一和第二的比较刺激在图2中补充3D。

对于我来说,当我不知道每个数据点对应什么时,就不可能评估钙成像实验的稳健性,以图2I为例。这些是单个细胞还是单个培养的许多细胞的平均值?这篇论文确实遗漏了许多关键的方法论细节。

是的。每个数据点对应于单个单元格。虽然我们对每种治疗进行了两到三次实验,但由于染色试剂和成像设置有时会改变,而且不可能将所有的测量数据合并到一个图表中,所以我们给出了来自一个代表性实验的数据。证明钙的反应确实是反复刺激的微量吸液管超声引导而不是由细胞损伤引起的,我们已经建立了一个新的成像系统在实验室进行实验再次使用Fura-2染色试剂和量化提出了F的比率340海里/ 380海里.结果如图2 - Figure supplement 2和Video 5所示。

同样的细胞被再次刺激,在超声刺激的持续时间内仍然显示良好的反应(图2 -图补充2)。光衰减问题导致了在不同抑制剂处理下保持相同视野的困难。因此,尽管抑制剂被应用于同一盘子,不同的视野被记录,以定量钙反应。我们手稿中呈现的n -数字代表了我们测试的一个子集,主要来自使用Invitrogen Oregon Green 488 BAPTA-1, AM, cell permeant的实验。当我们使用这个试剂,几乎每个视野测试细胞(> 90%)对超声刺激(视频3)。我们把吸管上的成像神经元或其40岁以下的神经突x物镜,钙响应可以观察到在1.5到5秒的时间点打开后的超声波。这可能是由于我们的记录设置的限制,通常是每秒捕获1或2张图像。在大多数的情况下,对1或2每视野可以量化神经细胞策划荧光(DF / F0)和时间(年代)。另一方面,如果表达载体Fluo-4,点,FluoroPure使用,只有28.6% -38.5%的视觉领域显示钙响应在超声波刺激(4)视频。当此染色法,每次处理都是用新鲜的细胞培养皿进行的。在图像记录后,我们从每个实验组中选择最上面的响应视野与对照组细胞培养皿进行对比。

ASIC1a是这种效应的关键中介的观点相当令人惊讶,结论看起来越戏剧性和不可信,所需的证据就越可靠。作者应该在体内和体外使用ASIC1a突变小鼠来证明ASIC1a确实是至关重要的。这同样适用于对神经发生的明显影响。

我们准备好的Asic1a基因缺失小鼠(Asic1a-/-),Asic3基因缺失小鼠(Asic3-/-)用于IHC实验测量p-ERK反应,以解决审稿人对是否Asic1a对小鼠的经颅超声刺激起着重要作用。经颅超声诱导小鼠皮层、海马和杏仁核等不同区域的p-ERK反应(代表性显微图7)A, b, h, i, o, p),虽然激活部分被废除在Asic1a-/-(图7C d j k q r).因此,Asic1a-/-在大脑的三个区域中的经颅超声刺激时导致P-ERK反应变得无统计学意义(图7G, N, U).另一方面,影响Asic3-/-p-ERK对超声的反应不明显(图7)E f l m s t).因此,超声诱导的p-ERK反应仍具有统计学意义(图7)G, N, U).p-ERK细胞计数的双向方差分析分析表明,只有两个因素的交互作用,即基因型和超声治疗大脑皮层(F = 6.45, p = 0.0037),但不是在海马和杏仁核(图7-table补充1)。为了进一步确认ASIC1a特定功能的调节超声波刺激,我们包括了Asic3-/-在我们的p-ERK反应表型研究中,基因型并没有减少p-ERK的激活Asic1a-/-所做的。这些结果表明p-ERK响应在老鼠大脑可能直接引起的继发效应引起的经颅超声,而不是由于听觉神经元连接电路或其他感官电路,ASIC3是主要表现在躯体感觉神经元和螺旋神经节神经元(1、2)。

我们发现连续超声刺激导致DCX水平升高。虽然我们只报告了第一批6周大的小鼠产生的数据,但我们的合作伙伴的另外两个实验室已经独立地证实了这一现象。为了解决审稿人的担忧,我们又用老鼠做了同样的实验Asic1a-/-(图6)。

视频显示超声波对培养物有很大的物理影响(细胞四处移动)。这是有问题的,因为它可能是什么钙信号纯粹指示细胞损伤。应提供控制措施,以确保情况并非如此。

之前我们的数据是通过Invitrogen Oregon Green 488 BAPTA-1染色试剂,AM,细胞渗透收集的。确保钙反应不是由于细胞损伤,我们执行一个实验与超声波400 mvpp输入电压和占空因数10%(视频5)。这个条件下的细胞检测不移动而显示清楚局部钙反应与Fura-2染色,这需要成像系统记录F340海里/ 380海里.如图2 -图2所示,我们连续刺激细胞。

虽然第一次刺激后出现明显的光衰减,但细胞可在5-10分钟后恢复,并在第二次刺激后显示出良好的钙反应(图2 -图2B)。同样,在Oregon Green 488 bapta -1染色的细胞中,重复刺激相同的细胞也很明显,如图2-figure supplement 3D所示。除了第二轮刺激外,尽管有显著的光漂白效果,0.01%皂苷处理导致的细胞穿孔的钙反应呈现出不同的曲线,如图2 -图中补充3C所示。

参考文献

1.s . h .林et al。ASIC3参与本体感受器感觉机械转导的证据。Nat Commun711460(2016)。

2.吴文丽,王春华,黄恩英,陈春春,Asic3(-/-)听觉障碍对幼鼠社会发育的影响。《公共科学图书馆•综合》4,E6508(2009)。

[编者注:在接受之前建议进一步修订,如下所述。]

评论家# 3:

作者做出了很大的努力,在手稿中添加了新的数据。最值得注意的是对ASIC1和ASIC3敲除小鼠模型中超声诱导的神经元激活(pERK作为替代)的新分析。作者注意到ASIC1-/-小鼠中pERK阳性细胞的基线数量较高,但超声暴露后未见增加。这一数据与ASIC3突变小鼠的数据相结合,ASIC3突变小鼠的超声效应没有衰减,更好地支持了ASIC1在超声效应中的作用。作者仍然应该注意到,这些数据暗示ASIC1在这种效应中发挥了必要的作用,但并没有表明这种三聚体通道的机械激活是体内效应的机制。例如,ASIC1的存在可能对该效应所必需的其他蛋白质的贩运或功能是必要的。事实上,作者至少应该在讨论中对ASIC1a对钠离子具有高度选择性这一事实进行评论,这一事实不能直接解释体外实验中测量到的钙内流。

作者们应该注意的另一个普遍观点是,他们断言ASIC1a是通过系绳门控的。据我所知,目前还没有直接的证据表明有一种分子链可以与这种蛋白质结合,从而控制通道。相反,这个断言是基于对衬底压痕可以激活这样一个通道的观察(来自Chen实验室的工作)。然而,PIEZO和TRPV4通道也显示了这一点。这些数据在PMID: 24981693进行了简短回顾。

我们感谢审稿人Gary R Lewin教授和编辑Rohini Kuner教授对我们的工作进行了彻底的检查,并努力帮助我们完善数据解释和声明。

我们采纳了所有的建议并修改了我们的手稿,如下所示。

1.原文本第47行:

“ASIC1A和系带模式机电调用涉及低强度超声介导的机电图和培养的神经元激活,其被ASIC1A阻断和细胞骨架改性剂抑制。”

句子改为第47行:

“ASIC1a和细胞骨架蛋白参与了低强度超声介导的机械转导和培养神经元的激活,而这被ASIC1a阻断剂和细胞骨架修饰剂抑制。”

2.原文本第75-79行:

机械力敏感离子通道主要分为双层模型,如由膜张力变化门控的PIEZO和TRP通道,以及胞外基质栓系模型,如酸敏感离子通道(ASICs)(8-10)。在这里,我们的目标是确定在小鼠大脑中可能的机械传感器,可以直接对低强度超声波作出反应。

句子改为第77-80行:

机械敏感离子通道,如PIEZO和TRP通道和酸敏感离子通道(ASICs)(8-10)被认为是可能对超声反应的候选通道。在这里,我们的目标是确定小鼠大脑中可能的机械传感器,可以对低强度超声波做出反应。”

3.原文本第174-176行:

先前的研究表明asic参与了栓系模式的机械转导,这依赖于完整的细胞骨架结构(8,13)。

句子改为184-186:

“以前的研究表明,ASIC涉及系列模式机械调节,这依赖于完整的细胞骨骼结构(8,13)。”

4.原始文本行180-183:

经过整理的数据揭示了一种新的超声机械转导模式,它结合了压缩力和剪切力,通过栓链模式机械转导激活小鼠神经元中的ASIC1a通道(图3)F).

句子改为第190-192行:

“经过整理的数据揭示了一种结合压缩力和剪切力的新型超声机械转导模式,它激活了小鼠神经元中的ASIC1a通道(图3)F).”

5.解决ASIC3是否可能导致超声引起的变化的问题。

在第261-263行添加句子:

的包容Asic3-/-ASIC3在体感神经元、三叉神经节神经元和螺旋神经节神经元中高度表达。”

6.原文本第259行:

为了进一步证实ASIC1a在介导超声刺激中的特异功能,

句子改为第278行:

“为了测试周围神经是否在介导超声波刺激中发挥作用,”

7.解决ASIC3是否有助于超声诱导的变化的问题。

在第308-319行添加句子:

“虽然目前的观点认为经颅超声激活大脑中的神经元是通过听觉神经(22),我们的结果来自Asic3-/-提示外周神经可能在低强度超声激活小鼠大脑p-ERK过程中不起作用。另外,低强度超声介导的机械转导可能通过特定于ASIC1a的通道亚型依赖方式发挥作用,但对其他ASIC亚型没有作用,如葡萄糖促治疗(23)所示。”

8.原文第306行:

为了解释超声波如何通过系绳模式机制激活ASIC1A,

句子改为第341行:

“解释超声波诱导的ASIC1A机械化模式,”

9.原文本第309-310行:

考虑到体外锚链模型,

句子改为第348-349行:

"考虑到体外的组合力模式"

10.解决ASIC1a的问题是作为钠通道,而不是钙通道。

向第353-355行添加句子:

“因此,机械信号触发ASIC1a,本质上是一个钠通道,可能通过激活电压门控钙通道导致细胞内钙离子升高(30)。”

11.原文本第314-320行:

另一方面,在体内的锚拉条件(图3 -图补充1)是不同的。神经元嵌于细胞外基质(土黄色),如大脑中的层粘连蛋白、多赖氨酸或多鸟氨酸。当超声应用于大脑时,细胞外基质锚定ASIC1a(土箭头),而细胞骨架变化将其拉向不同的方向(紫色箭头),导致细胞激活,表现为ERK磷酸化。

句子改为第356-369行:

“另一方面,体内的条件(图3-数字补充1)是不同的。神经元嵌于细胞外基质(土黄色),如大脑中的层粘连蛋白、多赖氨酸或多鸟氨酸。ASIC1A在N366和N393处是N-糖基化,两个残留物位于(31)。据报道据报道N-糖基化参与ASIC1(31,32)的表面贩运和树突脊柱运输,已知许多蛋白质的N-糖基化对于粘附和迁移(33-35)是重要的,这意味着N-聚糖的细胞外基质相互作用。当超声施加到大脑时,通过细胞外基质施加的声压可以通过细胞骨骼依赖性方式激活ASIC1a(图3-数字补充1),除了其他机械敏感机器,如压电和TRPV4(36,37),由于这些机械师已被证明被缩进的基材的凹陷触发。因此,这导致表现为ERK磷酸化的细胞的激活。“

12.原文本第328-331行:

低强度超声可通过栓系机制转导和ASIC1a直接激活神经元,为超声神经调节的进一步发展提供了分子基础。

句子改为第384-386行:

“低强度超声可以通过ASIC1a直接激活神经元,为未来的超声神经调节的发展提供分子基础。”

13.原文本第695-696行:

在体内环境下的栓系模式机械转导模型。

句子改为第785-786行:

"在体内情况下的机械转导模型示意图"

14.下面的图片我们在显微照片中添加了比例尺:

图2图补充2

图5

图6

图7图补充1

https://doi.org/10.7554/eLife.61660.sa2

文章和作者信息

作者详细信息

  1. Jormay Lim

    国立台湾大学医学工程学院生物医学工程系,台北市
    贡献
    概念化,数据整理,形式分析,调查,方法,项目管理,监督,验证,写作-初稿,写作-审查和编辑
    同样贡献
    戴晓新,廖伟豪,朱亚程
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000 - 0001 - 7191 - 545 - x
  2. Hsiao-Hsin大

    国立台湾大学医学工程学院生物医学工程系,台北市
    贡献
    数据管理,形式分析,调查,方法,验证
    同样贡献
    廖伟豪,朱亚程
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  3. Wei-Hao廖

    国立台湾医院大学物理医学与康复学系,台北市
    贡献
    数据管理,形式分析,调查,方法论
    同样贡献
    林乔美、戴晓新、朱亚程
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  4. Ya-Cherng楚

    国立台湾大学医学工程学院生物医学工程系,台北市
    贡献
    概念化,数据管理,验证,写作-审查和编辑
    同样贡献
    林乔美,戴晓新,廖伟豪
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0002-6408-2813
  5. 陈明郝

    国立台湾大学医学工程学院生物医学工程系,台北市
    贡献
    数据管理,形式分析,调查,方法论
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  6. Yueh-Chun黄

    国立台湾大学医学工程学院生物医学工程系,台北市
    贡献
    数据管理,形式分析,方法,验证
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  7. Cheng-Han李

    中央研究院生物医学研究所,台北,台湾
    贡献
    动物实验、方法
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  8. Shao-Shien林

    国立台湾医院大学外科,台北市
    贡献
    数据管理,形式分析,方法,验证
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  9. 雪莉许

    国立台湾大学医学工程学院生物医学工程系,台北市
    贡献
    数据管理,形式分析,调查
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  10. Ya-Chih简

    中央研究院生物医学研究所,台北,台湾
    贡献
    方法
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  11. Dar-Ming赖

    国立台湾医院大学外科,台北市
    贡献
    资金获取,资源,监督
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  12. Wen-Shiang陈

    国立台湾医院大学物理医学与康复学系,台北市
    贡献
    资金获取,资源,监督
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  13. 支正陈

    中央研究院生物医学研究所,台北,台湾
    贡献
    概念,方法,监督,可视化,写作-审查和编辑
    为对应
    chih@ibms.sinica.edu.tw
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
  14. Jaw-Lin王

    国立台湾大学医学工程学院生物医学工程系,台北市
    贡献
    概念化,资金获取,项目管理,资源,监督,写作-审查和编辑
    为对应
    jlwang@ntu.edu.tw
    利益争夺
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0002-5734-9276

资金

台湾科技部(大多数107-2221-E-002-068-MY3)

  • Jaw-Lin王

科技部,台湾(MOST108-2321-B-002-047)

  • Jaw-Lin王

台湾科技部(大多数108-2321-B-002-061-MY2)

  • Jaw-Lin王

国立卫生研究院(nri - ex109 - 10924ei)

  • Jaw-Lin王

科技部,台湾(MOST 108-2321-B-001-028-MY2)

  • 支正陈

科技部,台湾(MOST 110-2321-B001-010)

  • 支正陈

国立台湾大学(NTU-CC-107L891105)

  • Jaw-Lin王

资助者在研究设计,数据收集和解释中没有作用,或决定提交出版物的工作。

确认

本研究由台湾科技部(MOST 107-2221-E-002-068-MY3, MOST108-2321-B-002-047, MOST 108-2321-B-002-061-MY2),台湾国立卫生研究院(nri - ex109 - 10924ei),国立台湾大学(NTU-CC-107L891105)资助;台湾科技部(MOST 108-2321-B-001-028-MY2, MOST 110-2321-B-001-010)对CCC的资助。

道德

动物工作已按照国立台湾大学《实验动物护理和使用指南》的建议进行。所有动物处理均符合台大医院IACUC协议#20190055。

高级编辑

  1. 安德鲁·J·金,英国牛津大学

检查编辑器

  1. Rohini Kuner, Universität海德堡,德国

出版的历史

  1. 预印本发布:2020年7月10日(查看预印)
  2. 收稿日期:2020年7月31日
  3. 录用日期:2021年9月22日
  4. 接受的手稿发表:2021年9月27日(版本1)
  5. 出版版本:88必唯一官网登录

版权

©2021,Lim等。

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    Renée S Koolschijn等。
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    大脑在获取和储存记忆方面具有非凡的能力,这些记忆后来可以被选择性地回忆起来。这些过程由海马体支持,海马体被认为通过恢复存储在分布的新皮层回路中的信息来索引记忆回忆。然而,支持这种相互作用的机制仍不清楚。在这里,在人类中,我们表明,从配对的伙伴中回忆一个视觉线索,伴随着视觉皮层中谷氨酸和GABA之间的比率的短暂增加。此外,这些兴奋抑制波动是由海马体的活动预测的。这些数据表明,海马体通过索引信息存储在新皮层回路使用去抑制机制的记忆回忆。