1. 微生物学与传染病必威网球gydF4y2Ba
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Cryo EM揭示了新的物种特异性蛋白质和对称性元件gydF4y2Ba嗜肺性军团菌gydF4y2Ba点/ Icm T4SSgydF4y2Ba

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  8. 88必威 是通讯作者gydF4y2Ba
  1. 美国明尼苏达大学药学系gydF4y2Ba
  2. 美国范德比尔特大学医学中心病理、微生物与免疫学学系gydF4y2Ba
  3. 美国密歇根大学生命科学研究所gydF4y2Ba
  4. 韩国天主教大学生物技术学系,韩国gydF4y2Ba
  5. 美国密歇根大学微生物与免疫学系gydF4y2Ba
  6. 退伍军人事务部田纳西谷医疗保健系统,美国gydF4y2Ba
  7. 美国密歇根大学细胞与发育生物学系gydF4y2Ba
研究文章gydF4y2Ba
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  • 注释gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba这篇文章gydF4y2Ba作为:gydF4y2BaeLife 2021; 10: e70427gydF4y2Ba doi:gydF4y2Ba10.7554 / eLife.70427gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

嗜肺性军团菌gydF4y2Ba是一种机会性病原体,可导致称为退伍军人病的潜在致命肺炎。与感染相关的病理学取决于细菌通过跨膜Dot/Icm IV型分泌系统(T4SS)将效应蛋白输送到宿主体内。我们通过单粒子cryo-EM测定了Dot/Icm T4SS核心复合物的亚3.0Å分辨率图谱。高分辨率结构分析使我们能够识别编码在Dot/Icm基因座之外的蛋白质,这些蛋白质有助于核心T4SS结构。我们现在还可以定义两个不同的对称失配区域,一个连接C18周质环(PR)和C13外膜帽(OMC),另一个连接C13 OMC和16倍对称穹顶。出乎意料的是,PR和OMC之间的连接是DotH,OMC和PR之间夹着五个副本以适应对称性不匹配。最后,我们观察到重建中的多种构象,表明结构具有灵活性。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

IV型分泌系统(T4SS)是许多细菌和一些古菌利用的大分子机器。几种致病菌,如gydF4y2Ba嗜肺军团菌,幽门螺杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba百日咳杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba布鲁氏菌,gydF4y2Ba和gydF4y2Ba巴尔通氏体属gydF4y2Ba,利用T4SSs将细菌分子(核酸或蛋白质)传送到宿主的细胞质中(gydF4y2Ba克里斯蒂等人,2014年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba葛尔曼等人,2018年gydF4y2Ba).这些效应分子的活性导致多种人类疾病,包括肺炎、胃癌、百日咳和“猫抓热”(gydF4y2Ba克里斯蒂等人,2014年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba葛尔曼等人,2018年gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

革兰氏阴性菌中的T4SSs至少包含12个组分(原型系统中命名为VirB1-VirB11和VirD4),这些组分被组织成一种跨越内外膜的结构。T4SSs的结构至少可以细分为四种不同的特征:外膜核心或帽(OMC),内膜复合物,胞质atp酶的补体,在某些物种中,还有胞外绒毛(gydF4y2Ba克里斯蒂等人,2014年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba葛尔曼等人,2018年gydF4y2Ba;gydF4y2BaFronzes等人,2009年gydF4y2Ba;gydF4y2BaGordon等人,2017年gydF4y2Ba;gydF4y2BaWaksman 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaLow et al., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba冈萨雷斯-里维拉等人,2016年gydF4y2Ba).虽然这些特征中的一些在物种之间被保留了下来,但在不同的系统之间,确切的结构是不同的。例如,最近的结构研究gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2BaDot/Icm和gydF4y2Ba幽门螺旋杆菌gydF4y2BaCag T4SSs揭示了一个周质环(PR),该环在“最小化”系统中未被识别(gydF4y2BaGhosal等人,2017年gydF4y2Ba;gydF4y2BaGhosal等人,2019年gydF4y2Ba;gydF4y2BaChetrit等人,2018年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba帕克等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaChang et al., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaChung等人,2019年gydF4y2Ba;gydF4y2BaSheedlo等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba胡等人,2019年gydF4y2Ba).本文还描述了两个系统的OMC和PR之间的对称不匹配,其中C13:C18 (OMC:PR)不匹配gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2Ba点/Icm T4SS和C14:C17 (OMC:PR)不匹配gydF4y2Ba幽门螺旋杆菌gydF4y2BaCag T4SS。虽然两个系统的OMC和PR之间的连接不能被建模,但我们发现gydF4y2Ba幽门螺旋杆菌gydF4y2BaVirB9同系物(称为CagX)在OMC和PR中都存在,导致了关于这些系统中如何适应对称不匹配的问题。虽然在细菌II型(T2SS)、III型(T3SS)和VI型(T6SS)分泌系统中也发现了类似的对称失配现象,但在结构特征为t4ss的系统中,PR是不同的,这表明其保护是有用的(gydF4y2BaGhosal等人,2019年gydF4y2Ba;gydF4y2BaChung等人,2019年gydF4y2Ba;gydF4y2BaSheedlo等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaChernyatina和Low, 2019年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba胡等人,2018年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba迪克斯等人,2018年gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

的Dot/Icm复合体gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2Ba是已知最大的t4ss之一。对细胞内复制缺陷突变体的遗传筛选鉴定出26个基因,命名为gydF4y2Ba点gydF4y2Ba(细胞器移动缺陷)或gydF4y2BaicmgydF4y2Ba(细胞内增殖),T4SS功能所需(gydF4y2Ba西格尔等人,1998gydF4y2Ba;gydF4y2Ba西格尔和舒曼,1999年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba伯杰和伊斯伯格,1993年gydF4y2Ba;gydF4y2BaVogel等人,1998gydF4y2Ba)。Dot/Icm T4SS有多达300种蛋白质底物,与gydF4y2Ba幽门螺旋杆菌gydF4y2BaCag和gydF4y2Bab .百日咳gydF4y2BaPtl T4SSs,每一种仅运输一种毒力因子(gydF4y2Ba施罗德,2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba菲舍尔,2011年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba贝克特等人,2017年gydF4y2Ba;gydF4y2BaShrivastava和Miller, 2009年gydF4y2Ba).Dot/Icm“核心复合物”(跨越内外膜)最初被预测只包含5种蛋白质:DotC、DotD、DotF、DotG和do (gydF4y2BaKubori等人,2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba永井和久堀,2011年gydF4y2Ba).最近,我们描述了DotC、DotD和do的部分结构和位置,以及另外两种与OMC相关的蛋白质,DotK和Lpg0657 (gydF4y2BaGhosal等人,2019年gydF4y2Ba;gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaKubori等人,2014gydF4y2Ba)然而,该图中的几个特征无法明确识别,包括PR、OMC内的三条链以及位于OMC中心的低分辨率“穹顶”,我们预测该穹顶会破坏外膜(gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba).由于穹顶无法被分解,我们无法模拟Dot/Icm T4SS孔隙,该孔隙有助于货物通过外膜的转移。从缺失突变株中纯化的T4SS颗粒的结构和质谱分析显示,OMC中有两条未识别的链不是DotG或DotF,因为与WT T4SS相比,突变株T4SS中这些未指定区域的结构结构没有变化(gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba).因此,为了提高我们对Dot/Icm T4SS组织的理解,我们使用额外的低温电磁数据收集和分析,以提高地图的分辨率和质量,使我们能够为之前未识别的复杂区域建立详细的模型。在这里,我们报告的结构和组织gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2BaDot/Icm T4SS OMC和PR的分辨率使我们能够识别几十年的基础遗传和生化工作或最近的尖端冷冻电子断层扫描之前未检测到的新成分。此外,这项工作揭示了OMC和PR之间的对称失配是如何调节的,这一观察结果可能有助于理解同源系统中的对称失配元素。此外,我们还发现了圆顶和OMC其余部分之间的另一个意外对称性失配,这是在其他结构特征T4SS中未观察到的特征,同时也表征了圆顶和OMC之间的结构灵活性。gydF4y2Ba

结果与讨论gydF4y2Ba

Dot/Icm T4SS的地图重建gydF4y2Ba

我们使用单粒子低温em方法确定了Dot/Icm T4SS的3.8 Å不对称重建(C1)。这种分辨率使得追踪包含13个不对称单元的OMC和包含18个不对称单元的PR之间的连接成为可能。出乎意料的是,我们观察到5条源自PR的肽链,PR和OMC之间夹有附着密度(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)尽管C1重建的分辨率不够高,无法确定该密度的分子组成,但其在复合物中的排列表明了调节PR和OMC之间对称性失配的机制。为了提高OMC和PR的分辨率,根据我们之前的报告,分别对OMC和PR应用C13和C18对称性(gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba).这两个地图的分辨率都提高到了2.8 Å (gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba).值得注意的是,在应用对称性之后,我们无法解析OMC中心的圆顶特征,这表明该区域包含另一种对称性,并且/或在结构上是灵活的。为了帮助更好地解决这一重要区域的地图,我们实施了最近开发的数据分析策略,3D变异性分析(3DVA) (gydF4y2BaPunjani和Fleet,2021年gydF4y2Ba).通过计算分析,我们以4.6 Å的全球分辨率计算了五幅不同的圆顶图,结果显示,与OMC的其他部分不同,圆顶是16倍对称的(gydF4y2Ba图1 -图补充gydF4y2Ba).因此,Dot/Icm T4SS有三个不同的对称区域,一个16倍对称的圆顶,一个13倍对称的OMC,和一个18倍对称的PR。gydF4y2Ba

Dot/Icm IV型分泌系统(T4SS)的结构。gydF4y2Ba

(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)不对称重建(gydF4y2BaC1gydF4y2Ba)的Dot/Icm T4SS包括外膜帽(OMC)(蓝色)、周质环(PR)(绿色)、不对称圆顶(灰色),以及夹在OMC和PR之间没有明显对称的额外密度(红色)。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)采用对称拼版的方法来提高OMC (C13对称)和PR (C18对称)的分辨率。gydF4y2Ba

Dot/Icm T4SS OMC的架构gydF4y2Ba

DotC、DotD的模型gydF4y2Ba1gydF4y2Ba, DotDgydF4y2Ba2gydF4y2Ba、do和DotK是在采用C13对称重建的OMC地图中构建的。虽然我们在之前的报告中介绍了部分模型(gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba),新的OMC图谱的质量使我们能够扩展许多这些模型,对OMC蛋白结构进行近乎完整的结构分析,更重要的是,可以在以前未定义的复合体区域内建立模型。我们现在提出了扩展的,更高分辨率的DotC模型(残基28-35,60-161和173-268),DotDgydF4y2Ba1gydF4y2Ba(24 - 162)残留,DotDgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(残基25-160)、DotH(残基271-361)和DotK(残基40-188)(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba图2-图1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba).这些扩展模型为这些蛋白质的n端排列提供了额外的见解,放置了预测的DotC (C19)、DotD的脂化位点gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(C19) DotDgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(C19)和DotK(C27)位于靠近外膜的位置(gydF4y2Ba图2-图补遗4AgydF4y2Ba;gydF4y2BaYerushalmi等人,2005年gydF4y2Ba).此外,我们在这些映射Lpg0657中建模,我们现在称之为Dis1(gydF4y2BaDgydF4y2Ba不/gydF4y2Ba我gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba,与我们先前的任务(gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba).然而,该模型包含了Dis1的n端(42-65和88-98残基)的一个新分解的延伸,它形成了两个螺旋,从OMC盘“向上”延伸,将它们放置在外膜附近,或者可能是内膜。之前的一项研究发现,一个转座子突变体中断Dis1基因,导致菌株在液体培养中复制和野生型菌株一样,但两者都有细胞内生长缺陷gydF4y2BaAcanthamoeba castellaniigydF4y2Ba骨髓来源的小鼠巨噬细胞,与Dis1在Dot/Icm T4SS功能中发挥重要作用一致(gydF4y2Ba古德温等人,2016年gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

Dot/Icm IV型分泌系统(T4SS)外膜帽(OMC)的不对称单位。gydF4y2Ba

OMC的非对称单元由一个DotC(棕色),DotF组成gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(紫色)、DotK(青色)、双色(橙色)、Dis1 (Lpg0657,蓝色)、Dis2 (Lpg0823,绿色)、Dis3 (Lpg2847,褐色)和两份DotD(红色和粉红色)。gydF4y2Ba

表1gydF4y2Ba
地图重建和模型细化。gydF4y2Ba
OMCgydF4y2Ba 公共关系gydF4y2Ba OMC /公关gydF4y2Ba
EMDB加入代码gydF4y2Ba 24005gydF4y2Ba 24006gydF4y2Ba 24004gydF4y2Ba
数据收集和处理gydF4y2Ba
放大gydF4y2Ba 81,000×gydF4y2Ba 81,000×gydF4y2Ba 81,000×gydF4y2Ba
电压(千伏)gydF4y2Ba 300gydF4y2Ba 300gydF4y2Ba 300gydF4y2Ba
总电子剂量(egydF4y2Ba-gydF4y2Ba/ A2)gydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 50gydF4y2Ba
散焦范围(µm)gydF4y2Ba -1.5到-2.1gydF4y2Ba -1.5到-2.1gydF4y2Ba -1.5到-2.1gydF4y2Ba
像素大小(A)gydF4y2Ba 1.1gydF4y2Ba 1.1gydF4y2Ba 1.1gydF4y2Ba
处理软件gydF4y2Ba CryoSPARC, ReliongydF4y2Ba CryoSPARC, ReliongydF4y2Ba CryoSPARC, ReliongydF4y2Ba
初始粒子(数量)gydF4y2Ba 1389426年gydF4y2Ba 1389426年gydF4y2Ba 1389426年gydF4y2Ba
最后一个粒子(数字)gydF4y2Ba 84886年gydF4y2Ba 43907年gydF4y2Ba 136818年gydF4y2Ba
地图磨b因子gydF4y2Ba -99.2gydF4y2Ba -82.8gydF4y2Ba -115年gydF4y2Ba
地图解析(一)gydF4y2Ba 2.8gydF4y2Ba 2.8gydF4y2Ba 2.8gydF4y2Ba
FSC阈值gydF4y2Ba 0.143gydF4y2Ba 0.143gydF4y2Ba 0.143gydF4y2Ba
模型细化与验证gydF4y2Ba
起始模型gydF4y2Ba 6 × 62gydF4y2Ba 6 × 64gydF4y2Ba 6 × 65gydF4y2Ba
FSCgydF4y2Ba
0.5gydF4y2Ba 2.8gydF4y2Ba 2.8gydF4y2Ba 4.0gydF4y2Ba
0.143gydF4y2Ba 2.7gydF4y2Ba 2.7gydF4y2Ba 3.8gydF4y2Ba
模型残留物gydF4y2Ba
全部的gydF4y2Ba 17,264gydF4y2Ba 5490gydF4y2Ba 23.286gydF4y2Ba
DotCgydF4y2Ba 28-35 60 - 161, 173 - 268gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 28–35, 57–161, 173–272gydF4y2Ba
DotDgydF4y2Ba1gydF4y2Ba 24 - 162gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 23 - 162gydF4y2Ba
DotDgydF4y2Ba2gydF4y2Ba 25 - 160gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 24 - 160gydF4y2Ba
DotFgydF4y2Ba1gydF4y2Ba 208 - 266gydF4y2Ba 208 - 266gydF4y2Ba
DotFgydF4y2Ba2gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 207 - 269gydF4y2Ba 207 - 269gydF4y2Ba
DotGgydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 791 - 824gydF4y2Ba 791 - 824gydF4y2Ba
难道gydF4y2Ba 271–361gydF4y2Ba 104 - 263gydF4y2Ba 104 - 361gydF4y2Ba
DotKgydF4y2Ba 40–188gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 38–188gydF4y2Ba
Dis1gydF4y2Ba 42 - 65, 88 - 234gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 42 - 65, 88 - 236gydF4y2Ba
Dis2gydF4y2Ba 40 - 115gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 39 - 116gydF4y2Ba
Dis3gydF4y2Ba 29–320gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 29–320gydF4y2Ba
未知的OMCgydF4y2Ba 122 - 130gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 1-54, 122 - 130gydF4y2Ba
未知的公关gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 1-38, 70 - 79gydF4y2Ba 1-38, 70 - 79gydF4y2Ba
ClashscoregydF4y2Ba 3.04gydF4y2Ba 0.67gydF4y2Ba 5.80gydF4y2Ba
清洁度gydF4y2Ba 1.42gydF4y2Ba 0.85gydF4y2Ba 2.22gydF4y2Ba
债券gydF4y2Ba
长度(A)gydF4y2Ba 0.003gydF4y2Ba 0.004gydF4y2Ba 0.012gydF4y2Ba
角(°)gydF4y2Ba 0.748gydF4y2Ba 0.785gydF4y2Ba 1.822gydF4y2Ba
拉马钱德兰(%)gydF4y2Ba
青睐gydF4y2Ba 95.3gydF4y2Ba 97.3gydF4y2Ba 94.5gydF4y2Ba
允许gydF4y2Ba 4.7gydF4y2Ba 2.7gydF4y2Ba 5.5gydF4y2Ba
异常值gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba
B-factorsgydF4y2Ba 55.3gydF4y2Ba 69.7gydF4y2Ba 165.0gydF4y2Ba
PDBgydF4y2Ba 7泥gydF4y2Ba 7 muegydF4y2Ba 7民大gydF4y2Ba

除了上面讨论的改进模型之外,这张新的地图还确定了在OMC中以前未知的三条链(简单地描述为“链1”、“链2”和“链3”)(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba).前一个' chain 1 '是Lpg0823,现在命名为Dis2(残基40-115,gydF4y2Ba图2 -图附录5AgydF4y2Ba).Dis2位于外膜附近,由两个叶组成,在序列和结构上都相似,它们被总共5个二硫键固定在一起,所有这些键在图中都显示出很强的密度(gydF4y2Ba图2-图补编5B-DgydF4y2Ba).通过对Dis2的DALI搜索,PDB条目之间没有明显的结构相似性,这使得很难推断它的功能(gydF4y2Ba河中沙洲,2020gydF4y2Ba).在一起,预测膜相互作用的位点在DotC, DotDgydF4y2Ba1gydF4y2Ba, DotDgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,DotK,将Dot/Icm T4SS固定在每个不对称装置的七个位置处的外膜上(gydF4y2Ba图2-图补编4EgydF4y2Ba).改进的密度图使我们能够可视化先前识别的Dot/Icm T4SS组分的新的结构特征和细节,并识别以前无法建模的肽链组成。这些区域的组织与它们预测的脂化位点的位置有关,提供了第一个分子洞察这个复合物是如何锚定在细菌的外膜上的。gydF4y2Ba

我们鉴定‘chain 2’为Lpg2847(29-320残基),现在称为Dis3。Dis3主要是β螺旋蛋白,是OMC盘向外径向延伸的“臂”的主要贡献者(gydF4y2Ba图2 -图补充6AgydF4y2Ba).Dis3由总共14个螺旋横档组成,在结构上类似于细胞膜相关蛋白gydF4y2BaParabacteroides distasonisgydF4y2Ba(基因BDI3087;PDB3J×8),gydF4y2Ba脆弱类杆菌gydF4y2Ba(基因BF0425;PDB 3 pet),gydF4y2Bab .百日咳gydF4y2Ba(pertactin;PDB 1轻拍,gydF4y2Ba图2 -图补充6BgydF4y2Ba).Dis3的外表面主要是电正的,潜在地促进了与外膜内瓣的电负性头基团的相互作用(gydF4y2Ba图2 -图补充6CgydF4y2Ba).值得注意的是,Dis3的c端连接OMC内的三种不同的蛋白质:Dis1, DotK和DotDgydF4y2Ba1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图2 -图补充6DgydF4y2Ba).通过使用四种生物学上独立的纯化物(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)Lpg2847先前被鉴定为具有lpg2848或snrnA的双基因操纵子的一部分,snrnA是由gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2BaT2SS (gydF4y2BaRossier等人,2009年gydF4y2Ba).制备srnA和dis1基因插入突变体,并检测其通过T2SS (gydF4y2BaRossier等人,2009年gydF4y2Ba).dis1突变体在原生动物宿主中没有生长缺陷gydF4y2Ba蠕形线虫gydF4y2Ba,是一种被广泛接受的T2SS功能检测方法,但尚未对T4SS的组装或功能进行专门检测(gydF4y2BaRossier等人,2009年gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

表2gydF4y2Ba
分离的复合物样品中的点/Icm蛋白。gydF4y2Ba
光谱数gydF4y2Ba__gydF4y2Ba
确定蛋白质gydF4y2Ba 基因数量gydF4y2Ba*gydF4y2Ba 准备1gydF4y2Ba 准备2gydF4y2Ba 准备3gydF4y2Ba 准备4gydF4y2Ba
DotGgydF4y2Ba‡gydF4y2Ba Q5ZYC1gydF4y2Ba 112gydF4y2Ba 114gydF4y2Ba 195gydF4y2Ba 150gydF4y2Ba
DotFgydF4y2Ba Q5ZYC0gydF4y2Ba 94gydF4y2Ba 69gydF4y2Ba 101gydF4y2Ba 107gydF4y2Ba
队伍gydF4y2Ba Q5ZS33gydF4y2Ba 38gydF4y2Ba 65gydF4y2Ba 60gydF4y2Ba 69gydF4y2Ba
Dis3gydF4y2Ba Q5ZRN3gydF4y2Ba 22gydF4y2Ba 24gydF4y2Ba 41gydF4y2Ba 87gydF4y2Ba
小家伙gydF4y2Ba Q5ZYB6gydF4y2Ba 37gydF4y2Ba 38gydF4y2Ba 47gydF4y2Ba 27gydF4y2Ba
难道gydF4y2Ba Q5ZYC2gydF4y2Ba 28gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba 28gydF4y2Ba 47gydF4y2Ba
IcmFgydF4y2Ba Q5ZYB4gydF4y2Ba 15gydF4y2Ba 18gydF4y2Ba 36gydF4y2Ba 38gydF4y2Ba
IcmXgydF4y2Ba Q5ZS30gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba 13gydF4y2Ba 28gydF4y2Ba 33gydF4y2Ba
DotLgydF4y2Ba Q5ZYC6gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 26gydF4y2Ba 20.gydF4y2Ba 32gydF4y2Ba
DotDgydF4y2Ba Q5ZS45gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba 33gydF4y2Ba
DotCgydF4y2Ba Q5ZS44gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba 16gydF4y2Ba 22gydF4y2Ba
DotBgydF4y2Ba Q5ZS43gydF4y2Ba 16gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
Dis1gydF4y2Ba Q5ZXS4gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 16gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba
多提gydF4y2Ba Q5ZYR7gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba
DotMgydF4y2Ba Q5ZYC7gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba
DotKgydF4y2Ba Q5ZYC5gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba
IcmWgydF4y2Ba Q5ZS31gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba
DotZgydF4y2Ba Q5ZV91gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba
真不gydF4y2Ba Q5ZYB7gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba
Dis2gydF4y2Ba Q5ZXA9gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba
DotIgydF4y2Ba Q5ZYC3gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba
IcmVgydF4y2Ba Q5ZS32gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba
IcmTgydF4y2Ba Q5ZYD1gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba
icmgydF4y2Ba Q5ZYD0gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba
  1. *gydF4y2Ba

    UniProtKB加入号码。gydF4y2Ba

  2. __gydF4y2Ba

    通过对嗜肺L. pneumophila(UniProt;2930个条目),使用Proteome Discoverer (v2.1, Thermo Scientific)。搜索参数为MS1产丝量10ppm,片段量0.1 Da。使用Percolator检测假发现率(FDR),保留FDR≤1%的蛋白/肽进行进一步分析。完整的结果在补充材料的补充文件1中。gydF4y2Ba

  3. ‡gydF4y2Ba

    此结构中标识的组件以粗体显示。gydF4y2Ba

这不是第一次直接从cryo EM密度图在Dot/Icm T4SS中描述其他成分。事实上,仅在2020年,就有三种蛋白质通过高分辨率cryo EM被鉴定为Dot/Icm T4SS的成分:Lpg0294(DotY)、Lpg0657(Dis1)和Lpg1549(DotZ)(gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaMeir等人,2020年gydF4y2Ba)虽然这三个基因与Dot/Icm T4SS的其他已知成分之间没有明显的联系,但有针对性的基因分析可能会揭示这些基因是如何整合到该系统中的。需要进一步的研究来探索这些新确定的Dot/Icm组件的功能。gydF4y2Ba

最后,我们确定' chain 3 '为DotF (DotFgydF4y2Ba1gydF4y2Ba残留物,208 - 266)。这部分DotF由一个小的球状褶皱组成,由两个β片组成,每个β片由三条线组成(gydF4y2Ba图2 -图补充7AgydF4y2Ba).DotF的一面与Dis3的横档9、10和11交互(gydF4y2Ba图2 -图补充7BgydF4y2Ba)两种蛋白质之间的界面由氢键、疏水相互作用和盐桥组成(gydF4y2Ba图2 -图补充7CgydF4y2Ba).对DotF的这部分进行了DALI搜索,结果有几个结果,最明显的是来自gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba被称为GspC (PDB 3OSS)和一种绒毛蛋白gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba叫做PilP (PDB 21C4,gydF4y2Ba图2 -图补充7DgydF4y2Ba).与DotF一样,两种结构相似的蛋白质都在各自系统的周质中发现(gydF4y2BaKorotkov等人,2011年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba塔曼等人,2011年gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

Dot/Icm T4SS PR的架构gydF4y2Ba

在PR的C18对称图中总共有四条链。其中三条链被明确确定为DotF(DotF)第二个副本的一部分gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)、DotG和do,其中一条链无法识别,留下聚丙氨酸链模型(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba和gydF4y2Ba图3 -图补充剂gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).位于PR内部的是DotG的一部分(残基791-824),由一个单螺旋组成,从PR的内膜一侧开始,后面是一个短环,延伸到外膜或复合物的“顶部”(gydF4y2Ba图3-图增补3AgydF4y2Ba).DotG的短环接触到两个由四个和五个β链组成的含有104-263 (gydF4y2Ba图3-图补编3BgydF4y2Ba)。在PR中观察到的DotG/DotH之间的相互作用在结构上与先前报告的VirB10/VirB9和CagX/CagY类似,可能反映了在PR中保留该组织的重要功能(gydF4y2BaSheedlo等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaSgro等人,2018年gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

周质环(PR)的不对称单位。gydF4y2Ba

(gydF4y2Ba一个gydF4y2BaDot/Icm IV型分泌系统(T4SS)的PR至少由4条肽链组成。其中三种被鉴定为DotG(黄色)、do(橙色)和DotFgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(紫色)。第四个链无法识别,显示为灰色。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)在非对称单元中,我们观察到DotF之间的相互作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba难道和DotH-DotG。gydF4y2Ba

其结构与VirB9 (PDB 6GYB,残基27-133)和CagX (PDB 6 × 6 J,残基32-311)的n端区域相似,使其成为VirB9 (gydF4y2Ba图3-图补遗3CgydF4y2Ba,D)尽管序列相似性很小(gydF4y2BaSheedlo等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaSgro等人,2018年gydF4y2Ba).在PR中,DotG和DotG的排列类似于VirB9/VirB10 (PDB 6GYB)之间的相互作用gydF4y2Ba黄citrigydF4y2BaT4SS和CagX/CagY (PDB 6X6J)在PR内gydF4y2Ba幽门螺旋杆菌gydF4y2BaCag T4SS (gydF4y2Ba图3-图补编3EgydF4y2Ba;gydF4y2BaSheedlo等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaSgro等人,2018年gydF4y2Ba).有趣的是,gydF4y2Bax citrigydF4y2BaT4SS核心复合物比Dot/Icm和Cag T4SSs更小,组成成分更少,其与Dot/Icm和Cag T4SSs的PR结构相似的区域以前没有被认为是一个单独的区域gydF4y2Bax citrigydF4y2Ba复杂的核心。相反,以前的报告描述了外部和内层gydF4y2Bax citrigydF4y2BaT4SS (gydF4y2BaSgro等人,2018年gydF4y2Ba).然而,当比较Dot/Icm和Cag T4SSs的结构与原型gydF4y2Bax citrigydF4y2BaT4SSs,它的内层现在应该被认为在结构上与较大的Dot/Icm和Cag T4SSs的PR区域相似。重要的是,一个主要的区别gydF4y2Bax citrigydF4y2BaT4SS是其核心复合物的外层和内层共享相同的对称算子(C14),而不是像Dot/Icm和Cag T4SS所观察到的对称不匹配。gydF4y2Ba

位于紧邻的DotF和PR的外围是一个小的球状结构域,我们确定它为DotF(残基207-269)。这部分DotF由在OMC中发现的相同残留物组成(DotFgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),因此,很可能代表了DotF的唯一副本,我们称之为DotFgydF4y2Ba2gydF4y2Ba. 多夫gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在结构上与DotF模型几乎相同gydF4y2Ba1gydF4y2Ba构建在OMC的C13对称性地图中(RMSD为0.5 Å)。这导致在完整的Dot/Icm T4SS (gydF4y2Ba图3-图补遗4AgydF4y2Ba)多夫先生gydF4y2Ba2gydF4y2Ba使用与DotF相似的接口进行绑定gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和Dis3,埋藏面积分别为575和655 Å (gydF4y2Ba图3-图补编4B-DgydF4y2Ba).gydF4y2Ba

在不对称映射中构建的模型gydF4y2Ba

由2.8 Å分辨率生成的模型,对OMC和PR进行对称重建,适合于Dot/Icm T4SS的3.8 Å地图,该地图是在不施加对称的情况下生成的。所有模型都很好地符合不对称图,只观察到每个蛋白质的主原子位置有微小的变化(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba图4-图1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba).值得注意的是,我们在不对称重建中建模了地图中包含额外密度的两个区域的部分。首先,我们观察到在OMC和PR之间的13个不同构象的连接(鉴定为264-270残基),揭示了这两个区域之间的直接连接。其次,我们观测到位于OMC和PR之间的5个小球状褶皱(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba,gydF4y2Ba图4-图补编6A-CgydF4y2Ba).这些褶皱由两个β层组成,并在其中一个层中加入了来自于双唇的连接物作为额外的β链(gydF4y2Ba图4 -图补充6CgydF4y2Ba).仔细检查清楚显示,这些结构域包含的折叠与OMC中DotH的C-末端结构域几乎相同(残基278–360)。在将DotH的C-末端结构域拟合到图的这一部分时,寄存器与模型很好地相关,平均侧链CC值在0.68到0.72之间(gydF4y2Ba图4 -图补充6DgydF4y2Ba).我们建议这五个额外的域的难道c端域的5份不跨越OMC和公关之间的对称不匹配。因此,整个结构中有18份难道18“NTDs包括公关”,13 ctd扩展相关的构建OMC磁盘的一部分,而其他5个ctd只向中间空间延伸了一部分。在OMC和PR之间,每隔2到3个不对称单元就会出现一个中间的每个efc - c端结构域,并且它们被观察到的程度是不同的,这表明这些结构域的位置相对于PR或OMC不是静态的(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba视频1gydF4y2Ba).这五种ctd的灵活性表明了一种机制,通过这种机制,OMC和PR之间观察到的对称不匹配可以被容纳,尽管对称不匹配的效用无法推断。gydF4y2Ba

位于外膜帽(OMC)和周质环(PR)之间的结构域的结构。gydF4y2Ba

(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba在Dot/Icm IV型分泌系统(T4SS)的不对称重建中,我们在三个独立的地方观察到do(橙色),OMC(平面1),PR(平面3),以及两者之间的空间(平面2)。gydF4y2BaBgydF4y2Ba每个平面上的拷贝数是不同的。OMC(平面1)有13个对称副本,OMC与PR(平面2)之间有5个不对称副本,PR(平面3)有18个对称副本。gydF4y2Ba

视频1gydF4y2Ba
在Dot/Icm IV型分泌系统(T4SS)的不对称重建中,n -末端和c -末端结构域的位置。gydF4y2Ba

在Dot/Icm T4SS的不对称重建中,我们观察到的do(橙色)有三个不同的部分:膜帽(outer membrane cap, OMC),周质环(periplasmic ring, PR),以及OMC和PR之间的不对称区域。在PR中发现了18个n端结构域,在不对称区发现了5个c端结构域,在OMC中发现了13个c端结构域。gydF4y2Ba

有趣的是,我们没有看到类似的密度之间的OMC和PRgydF4y2Ba幽门螺旋杆菌gydF4y2BaCag T4SS,即使在该系统中也存在对称性失配,并且DotH在结构上与CagX相同。基于对对称性失配在Dot/Icm T4SS中的适应方式的理解,我们提出,在Cag T4SS中未发现的PR和OMC区域之间的灵活和/或动态连接对于D来说非常重要ot/Icm T4SS转运如此独特的大量分泌底物。尽管我们现在能够描述对称性失配是如何调节的,但其对功能的影响仍有待确定。gydF4y2Ba

穹丘密度包含了DotG的c端gydF4y2Ba

在cryoSPARC中使用3DVA重建了5张T4SS地图,解决了位于OMC中心的圆顶的二级结构(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba).为了进行这一分析,粒子必须从1.1到2.2 Å/pix下采样,导致全球分辨率较低,约为4.6 Å。在这个圆顶中有16个α螺旋,在这个分辨率下看起来几乎相同。由于该分辨率已经接近数据的Nyquist极限(~4.4 Å),采用C16对称性并没有提高地图的分辨率。然而,基于以往对T4SS的研究,我们推断这部分T4SS可能对应于提出的DotGgydF4y2Ba退伍军人gydF4y2Ba通过序列比较与VirB10同源(gydF4y2Ba永井和久堀,2011年gydF4y2Ba).的确,在Swiss model中使用VirB10作为模板生成的DotG的c端域模型符合解析圆顶密度(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba;gydF4y2BaWaterhouse等人,2018年gydF4y2Ba)这一发现与我们之前的观察结果一致,即Dot/Icm T4SS核心复合物从gydF4y2BadotGgydF4y2Ba缺失应变缺乏OMC的圆顶部分(gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba).有趣的是,DotG的16个拷贝和OMC磁盘的其余部分之间的接口是稀疏的,可能导致这部分地图的低分辨率重建(gydF4y2Ba视频2gydF4y2Ba).基于在PR内建模的DotG结构(残基791-824)和同源模型符合圆顶密度(约由残基857-1046组成),我们假设DotG从PR延伸到圆顶,尽管没有观察到两个结构之间的物理联系。这将导致在完整的Dot/Icm T4SS中总共有18个DotG副本,但由于结构不均一,可能有两个副本的DotG在圆顶内看不到。综上,我们建议Dot/Icm T4SS的最终化学计量值为31:26:18:18:18:13:13:13:13 (DotF:DotD:DotG: DotC:DotK:Dis1:Dis2:Dis3)。gydF4y2Ba

图5gydF4y2Ba附1份补编gydF4y2Ba见识gydF4y2Ba
在“圆顶”密度内建模DotG。gydF4y2Ba

(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)位于外膜帽(OMC)中心的“圆顶”密度在C1重建中无法解释(上),可能是由于结构异质性。经过三维变异性分析,在结构中部(底部)观察到明显的16倍对称,密度大大提高。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)穹顶不对称单元内的密度包含类似于VirB10同系物(顶部)的结构特征。DotG C-末端的模型是在瑞士模型中构建的,该模型在细化后符合该密度(底部)。gydF4y2Ba

表3gydF4y2Ba
三维变率分析(3DVA)地图重建和模型优化。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba 图2gydF4y2Ba 图3gydF4y2Ba 图4gydF4y2Ba 图5gydF4y2Ba
EMDB加入代码gydF4y2Ba 24018gydF4y2Ba 24020gydF4y2Ba 24023gydF4y2Ba 24024gydF4y2Ba 24026gydF4y2Ba
数据收集和处理gydF4y2Ba
放大gydF4y2Ba 81,000×gydF4y2Ba 81,000×gydF4y2Ba 81,000×gydF4y2Ba 81,000×gydF4y2Ba 81,000×gydF4y2Ba
电压(千伏)gydF4y2Ba 300gydF4y2Ba 300gydF4y2Ba 300gydF4y2Ba 300gydF4y2Ba 300gydF4y2Ba
总电子剂量(egydF4y2Ba-gydF4y2Ba/一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)gydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 50gydF4y2Ba
散焦范围(µm)gydF4y2Ba -1.5到-2.1gydF4y2Ba -1.5到-2.1gydF4y2Ba -1.5到-2.1gydF4y2Ba -1.5到-2.1gydF4y2Ba -1.5到-2.1gydF4y2Ba
像素大小(A)gydF4y2Ba 1.1gydF4y2Ba 1.1gydF4y2Ba 1.1gydF4y2Ba 1.1gydF4y2Ba 1.1gydF4y2Ba
处理软件gydF4y2Ba CryoSPARCgydF4y2Ba CryoSPARCgydF4y2Ba CryoSPARCgydF4y2Ba CryoSPARCgydF4y2Ba CryoSPARCgydF4y2Ba
初始粒子(数量)gydF4y2Ba 303,447gydF4y2Ba 303,447gydF4y2Ba 303,447gydF4y2Ba 303,447gydF4y2Ba 303,447gydF4y2Ba
最后一个粒子(数字)gydF4y2Ba 79720年gydF4y2Ba 75959年gydF4y2Ba 64698年gydF4y2Ba 42013年gydF4y2Ba 41057年gydF4y2Ba
地图磨b因子gydF4y2Ba -88.5gydF4y2Ba -85.4gydF4y2Ba -85年,8gydF4y2Ba -84.4gydF4y2Ba -80.1gydF4y2Ba
地图解析(一)gydF4y2Ba 4.6gydF4y2Ba 4.6gydF4y2Ba 4.6gydF4y2Ba 4.6gydF4y2Ba 4.6gydF4y2Ba
FSC阈值gydF4y2Ba 0.143gydF4y2Ba 0.143gydF4y2Ba 0.143gydF4y2Ba 0.143gydF4y2Ba 0.143gydF4y2Ba
模型细化与验证gydF4y2Ba
起始模型gydF4y2Ba 7民大gydF4y2Ba 7民大gydF4y2Ba 7民大gydF4y2Ba 7民大gydF4y2Ba 7民大gydF4y2Ba
FSCgydF4y2Ba
0.5gydF4y2Ba 4.6gydF4y2Ba 4.6gydF4y2Ba 4.6gydF4y2Ba 4.8gydF4y2Ba 4.8gydF4y2Ba
0.143gydF4y2Ba 4.5gydF4y2Ba 4.5gydF4y2Ba 4.5gydF4y2Ba 4.5gydF4y2Ba 4.5gydF4y2Ba
模型残留物gydF4y2Ba
全部的gydF4y2Ba 25,121gydF4y2Ba
DotCgydF4y2Ba 59 - 267gydF4y2Ba
DotDgydF4y2Ba1gydF4y2Ba 23 - 162gydF4y2Ba
DotDgydF4y2Ba2gydF4y2Ba 24 - 160gydF4y2Ba
DotFgydF4y2Ba1gydF4y2Ba 208 - 266gydF4y2Ba
DotFgydF4y2Ba2gydF4y2Ba 207 - 269gydF4y2Ba
DotGgydF4y2Ba 791–824, 862–978, 999–1046gydF4y2Ba
难道gydF4y2Ba 104 - 361gydF4y2Ba
DotKgydF4y2Ba 38–188gydF4y2Ba
Lpg0657gydF4y2Ba 42 - 65, 88 - 236gydF4y2Ba
Lpg0823gydF4y2Ba 39 - 116gydF4y2Ba
Lpg2847gydF4y2Ba 113 - 320gydF4y2Ba
未知的OMCgydF4y2Ba 122 - 130gydF4y2Ba
未知的公关gydF4y2Ba 1-38, 70 - 79gydF4y2Ba
ClashscoregydF4y2Ba 9.55gydF4y2Ba 9.64gydF4y2Ba 15.53gydF4y2Ba 9.47gydF4y2Ba 9.85gydF4y2Ba
清洁度gydF4y2Ba 2.80gydF4y2Ba 2.77gydF4y2Ba 2.76gydF4y2Ba 2.68gydF4y2Ba 2.73gydF4y2Ba
债券gydF4y2Ba
长度(A)gydF4y2Ba 0.006gydF4y2Ba 0.005gydF4y2Ba 0.003gydF4y2Ba 0.004gydF4y2Ba 0.004gydF4y2Ba
角(°)gydF4y2Ba 0.798gydF4y2Ba 0.765gydF4y2Ba 0.540gydF4y2Ba 0.702gydF4y2Ba 0.711gydF4y2Ba
拉马钱德兰(%)gydF4y2Ba
青睐gydF4y2Ba 94gydF4y2Ba 94.2gydF4y2Ba 94.7gydF4y2Ba 95.2gydF4y2Ba 94.7gydF4y2Ba
允许gydF4y2Ba 6.0gydF4y2Ba 5.8gydF4y2Ba 5.3gydF4y2Ba 4.8gydF4y2Ba 5.3gydF4y2Ba
异常值gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba
B-factorsgydF4y2Ba 147.96gydF4y2Ba 154.48gydF4y2Ba 146.18gydF4y2Ba 145.88gydF4y2Ba 145.07gydF4y2Ba
PDBgydF4y2Ba 7 muqgydF4y2Ba 7亩gydF4y2Ba 7 muvgydF4y2Ba 7 muwgydF4y2Ba 7是gydF4y2Ba
视频2gydF4y2Ba
利用三维变异性分析重建的地图中,DotC n端延伸的程度不同。gydF4y2Ba

在用于解析外膜帽(OMC)圆顶区域的五张图中,我们注意到DotC n端变化的程度相当大。DotC的扩展在每幅地图上只有4到5个副本。gydF4y2Ba

除了我们预测的圆顶部分是DotG外,还有两段DotC在我们之前的电子显微镜密度图中未被解析。这些包括内部连接(残留物162–172)和相对较长的N端延伸(残留物28–57,gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba图5 -图补充gydF4y2Ba).dot tc内部的桥由一个连接残基161和173的单环组成。相比之下,DotC的n端延伸模型为位于DotG附近的两个相对较大的螺旋,并桥接相邻的不对称单元(gydF4y2Ba图5-图补编1BgydF4y2Ba).值得注意的是,在每张地图上观察到的13份DotC副本中,只有4份或5份的DotC被观察到。包含此部分的DotC副本被定位,使此扩展与圆顶内的DotG处于类似的位置(gydF4y2Ba图5-图补编1BgydF4y2Ba和gydF4y2Ba视频3gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

视频3gydF4y2Ba
在Dot/Icm IV型分泌系统(T4SS)3D可变性重建图1中发现的DotG部分的位置。gydF4y2Ba

在穹窿密度范围内,我们观察到16个螺旋状突起,包含与VirB10相似的褶皱。这16个褶皱位于周质环(PR)中18个螺旋的正上方。据怀疑,磁盘内DotG的异质性是由于观察到DotG和DotC之间的稀疏接触以及连接此处所示两段DotG的柔性连接件引起的。gydF4y2Ba

DotG C-末端结构域在穹窿密度内的发现与先前假设DotG是VirB10同源物的报告一致。然而,我们意外地发现,在PR中的18个DotG副本中,Dot/Icm仅将16个DotG副本合并到OMC圆顶中,这导致了该系统中的另一个对称性不匹配。DotC的N端存在变异的发现也表明DotG和OMC盘其余部分之间的相互作用主要由DotC介导。未来的研究将寻求解决C16:C18(dome:PR)失配的起源,包括不跨越失配的两个DotG C末端结构域的位置和作用,以及DotC和DotG之间的相互作用。gydF4y2Ba

在比较使用3DVA确定的5张图时,DotG不仅对相对于OMC其余部分的“圆顶”位置进行了取样,而且PR对OMC盘也占据了不同的位置。指出,OMC磁盘是锚定到外膜多达七个交互/不对称单位(或超过90完成复杂),并观察到的多个构象OMC圆顶和公关相对于OMC磁盘,我们可视化连续分布的构象在电影的背景下(gydF4y2Ba视频4gydF4y2Ba).电影显示,Dot/Icm T4SS的OMC圆顶、OMC盘和PR可以适应彼此之间的不同方向,这表明综合体可以经历棘轮运动,圆顶和PR围绕中心轴来回旋转,通过对称不匹配的物理连接将复杂的不同区域连接在一起。这导致了一种预测,即复合物的多重对称失配和各种构象状态对于Dot/Icm T4SS如何比其他T4SS容纳更多的蛋白质底物非常重要(gydF4y2Ba施罗德,2017gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

视频4gydF4y2Ba
利用Dot/Icm IV型分泌系统(T4SS)的3D变异性分析重建图。gydF4y2Ba

利用3D变异性分析,我们重建了总共五张显示外膜帽(OMC)和周质环(PR)定位方式差异的图谱。这些地图确定了OMC内圆顶中心的大约16倍对称性。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

关键资源表gydF4y2Ba
试剂类型(种类)或资源gydF4y2Ba 指定gydF4y2Ba 源或引用gydF4y2Ba 标识符gydF4y2Ba 额外的信息gydF4y2Ba
应变,应变背景gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba嗜肺性军团菌gydF4y2Ba)gydF4y2Ba
Lp02;WTgydF4y2Ba PMID:gydF4y2Ba23717549gydF4y2Ba
软件、算法gydF4y2Ba MotionCor2gydF4y2Ba PMID:gydF4y2Ba28250466gydF4y2Ba
软件、算法gydF4y2Ba CTFFind4gydF4y2Ba PMID:gydF4y2Ba26278980gydF4y2Ba
软件、算法gydF4y2Ba cryoSPARCgydF4y2Ba PMID:gydF4y2Ba28165473gydF4y2BaPMID:gydF4y2Ba33582281gydF4y2Ba
软件、算法gydF4y2Ba RELIONgydF4y2Ba PMID:gydF4y2Ba27685097gydF4y2BaPMID:gydF4y2Ba30412051gydF4y2Ba
软件、算法gydF4y2Ba 库特gydF4y2Ba PMID:gydF4y2Ba20383002gydF4y2Ba
软件、算法gydF4y2Ba 加州大学旧金山分校嵌合体gydF4y2Ba PMID:gydF4y2Ba15264254gydF4y2BaPMID:gydF4y2Ba29340616gydF4y2Ba
软件、算法gydF4y2Ba 菲尼克斯gydF4y2Ba PMID:gydF4y2Ba29872004gydF4y2Ba
软件、算法gydF4y2Ba 大理服务器gydF4y2Ba PMID:gydF4y2Ba31263867gydF4y2BaPMID:gydF4y2Ba31606894gydF4y2Ba

菌株的准备gydF4y2Ba

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退伍军人gydF4y2Ba在pH为6.9、添加0.1 mg/ml胸苷、0.4 mg/ml l -半胱氨酸和0.135 mg/ml硝酸铁的ACES (Sigma)缓冲酵母提取物培养液中培养,或在添加15 g/l琼脂和2 g/l木炭的培养液中培养。的gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2Ba实验室菌株Lp02,来自临床分离费城-1 (gydF4y2BaRao et al., 2013gydF4y2Ba),已被利用。gydF4y2Ba

复合隔离gydF4y2Ba

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复合物是从野生型分离得到的gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2Ba菌株Lp02描述(gydF4y2BaDurie等人,2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaKubori等人,2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba久保里和永井,2019gydF4y2Ba).细胞悬浮在140 ml的缓冲液中,缓冲液中含有150 mM Trizma碱pH 8.0, 500 mM NaCl和无edta完全蛋白酶抑制剂(Roche),温度为4℃。悬浮液在工作台上培养,搅拌,直到达到环境温度。加入PMSF(终浓度1mm)、EDTA(终浓度1mm)和溶菌酶(终浓度0.1 mg/ml),悬浮液在室温下再孵育30 min。用洗涤剂和碱性裂解法裂解菌膜。Triton X-100 (20% w/v)加AG501-X8树脂(BioRad),然后滴加MgSOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba(终浓度3mm)、DNaseI(终浓度5 μg/ml)、EDTA(终浓度10 mM),然后用NaOH调节pH至10.0。其余步骤在4°C下进行。细胞裂解液12000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba用20分钟去除未溶解的物质。上清液以100,000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba待30分钟至成球团膜复合物。复膜微球重悬,在少量TET缓冲液(10 mM Trizma碱pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100)中浸泡过夜。重悬后的样品在14000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟后成颗粒碎片。上清液10万次超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba将得到的颗粒重悬在TET中,配合物在150 mM NaCl的TET缓冲液中使用AKTA Pure体系(GE Life Sciences)通过Superose 6 10/300柱层析进一步分离。从色谱柱上采集的样品用于显微镜观察。质谱分析如下所述(gydF4y2Ba安瓦尔等人,2018年gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

低温电磁法数据收集和地图重建gydF4y2Ba

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对于低温电子显微镜,将4 μl分离的Dot/Icm T4SS样品应用在Quantifoil 2/2 200 mesh copper grids上的辉光放电超薄连续碳膜上(电子显微镜服务)。将样品连续涂于网格中5次,每次涂后孵育60 s左右。然后在水中清洗网格以去除洗涤剂,然后使用FEI vitrobot在4°C和100%湿度的条件下,在液态乙烷浆中插入冷冻玻璃化。gydF4y2Ba

数据是在斯坦福大学slac低温电子显微镜(Menlo Park, CA)收集的,使用的是运行在300 keV的Titan Krios显微镜(Thermo Fisher, Waltham, MA),并配备了一个量子能量过滤器。使用K3 Summit直接电子探测器在计数模式下采集图像,标称放大倍率为81,000,对应的像素大小为1.1 Å。能量狭缝的宽度为15 eV。总剂量为50 e/ÅgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,在2.96秒内分割超过33帧。数据采集使用EPU软件(Thermo Fisher, Waltham, MA),名义离焦点范围从- 1.5到- 2.1 μm。共采集显微照片12263张。gydF4y2Ba

首先对视频帧进行剂量加权,并使用Motioncor2 (gydF4y2Ba郑等,2017gydF4y2Ba).对比传递函数(CTF)值采用CTFFind4 (gydF4y2BaRohou和Grigorieff, 2015年gydF4y2Ba).采用cryoSPARC、RELION 3.0和RELION 3.1进行图像处理(gydF4y2BaPunjani等人,2017年gydF4y2Ba;gydF4y2BaZivanov等人,2018年gydF4y2Ba).使用cryoSPARC中的模板选择器,从12204张显微照片中筛选出1389 426个粒子。粒子提取使用510像素的盒子大小(1.1 Å/pix)。提取的粒子在cryoSPARC中生成了具有代表性的二维粒子类,并保留了约13.6万个粒子。选定的粒子在cryoSPARC中的从头计算模型中使用,然后作为具有或不具有C13对称性的3D自动细化的参考(低通滤波到30 Å)。最后,利用溶剂掩膜和b因子对具有C13对称性和不具有C13对称性的三维图进行整体特征和分辨率的改进,重构出的三维图的整体分辨率分别为3.4 Å (C13)和3.8 Å (C1)。gydF4y2Ba

然后,C13精炼体积和相应的颗粒被出口到RELION进行集中精炼。利用RELION对选定的粒子进行光束倾斜值(ctf -精化)估计。使用ctf -精制的粒子堆栈,围绕核心复合物使用软掩膜进行C13对称施加的细化,得到了3.8 Å分辨率的3D地图。gydF4y2Ba

为了集中细化OMC盘,对包含OMC盘的每个粒子使用一个软掩模进行信号减法。对减去的粒子进行无对准聚焦三维分类(3类)。然后,利用C13对称性进行局部角搜索,对分辨率最好的OMC(~ 89000个粒子)进行屏蔽三维细化,得到分辨率为3.7 Å的密度图。使用RELION对选定的粒子进行每粒子离焦值(ctf -细化)估计。使用ctf -精细化粒子堆栈,在Dot/Icm T4SS核心复合物的OMC盘区域周围使用软掩膜进行C13对称强化精细化,得到分辨率为3.2 Å的3D地图,其中包含改进的结构特征。通过b因子锐化和FSC曲线的计算,得到了2.8 Å分辨率的OMC盘图。gydF4y2Ba

对PR的聚焦细化遵循相同的步骤,首先使用软遮罩对包含PR的每个粒子进行信号减除。对减去的粒子进行无对准聚焦三维分类(3类)。根据分类分布(粒子分布)、估计分辨率和三维密度图的比较,选择最佳分辨率的PR(~ 44000个粒子)三维分类。这个类随后使用C18对称性进行局部角搜索,得到7.5 Å分辨率的蒙版3D细化。使用RELION对选定的粒子进行每粒子离焦值(ctf -细化)估计。使用ctf -精制的粒子堆栈,在Dot/Icm T4SS核心复合物的PR区域周围使用软掩膜进行C18对称施加的细化,得到了4.1 Å分辨率的3D地图。与ctf改进之前的地图相比,这些地图包含了改进的特征。b因子锐化和蒙面FSC曲线的计算,最终得到分辨率为2.8 Å的PR图。gydF4y2Ba

在与聚焦细化不同的工作流程中,在cryoSPARC中进行了3DVA,以评估OMC圆顶的连续灵活性。在这项分析中,约136000个粒子得到了3.8 Å分辨率的图,没有上述的对称性,并且由于cryoSPARC的盒子大小限制,取样到250像素的盒子大小(~2.2 Å/pix)。从这些向下采样的粒子生成了一个新的从头计算模型,并进行了C1均匀细化,得到了一个4.6 Å图。然后使用从细化工作中向下采样的粒子和掩模进行3DVA,三种模式,过滤器分辨率为5 Å。3DVA显示作业以简单输出模式运行,每组20帧。所有星系团都显示出C16穹丘和C18 PR围绕旋转轴的排列差异,C13 OMC盘保持在相同的相对位置(gydF4y2Ba视频4gydF4y2Ba).然后3DVA显示作业在集群输出模式下运行,有五个集群。每个聚类中的粒子和映射分别进行C1均质细化。在每种情况下,生成的3D地图的分辨率都是4.6 Å。gydF4y2Ba

模型构建与细化gydF4y2Ba

请求一份详细的协议gydF4y2Ba

为了构建OMC的模型,首先在Pymol中提取了之前确定的OMC结构的不对称单元(PDB 6 × 62),并使用UCSF Chimera (gydF4y2Bapetersen等人,2004年gydF4y2Ba).然后在PHENIX中使用phoenix .real.space.refine (gydF4y2BaAfonine等人,2018年gydF4y2Ba)。然后在Coot中检查模型,并手动检查和纠正两张地图之间的任何细微差异。在适当的情况下,在Coot中扩展模型(gydF4y2BaEmsley等人,2010年gydF4y2Ba).本研究中鉴定的每一种成分(Lpg0823, Lpg2847和DotFgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)在Coot中重新构造,生成整个非对称单元的模型。然后在PHENIX中使用二级结构和Ramachandran约束对该模型进行了改进。通过调整非键权值,优化了优化策略。然后在PHENIX中通过应用对称性生成整个OMC的模型,并进一步细化如上所述。模型经手工检验是否合适,并在Phenix使用Phenix .validation.cryoem进行验证。以之前报道的聚丙氨酸模型(PDB 6 × 64)为起点,构建了上述PR模型。模型在Coot中被调整,对称,并在PHENIX中被精炼,基本上如上所述,以生成整个PR的模型。gydF4y2Ba

为了生成OMC模型,首先将这里描述的OMC和PR模型(分别为PDBs 7MUC和7muue)拟合到生成的不对称地图中。然后在PHENIX中对模型进行改进,在Coot中进行必要的调整。在Coot中手工生成了连接的模型。为了模拟OMC和PR之间的c端结构域,我们首先构建了聚丙氨酸模型。然后,将其与聚丙氨酸模型进行比对,并在Coot中手工精制。一旦完成,不对称模型就会在PHENIX中得到完善。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

所有型号和地图已上传到PDB和EMDB,登录号为:PDB 7MUD (EMDB 24005)、PDB 7muue (EMDB 24006)、PDB 7MUC (EMDB 24004)、PDB 7MUQ (EMDB 24018)、PDB 7MUS (EMDB 24020)、PDB 7MUV (EMDB 24023)、PDB 7MUW (EMDB 24024)、PDB 7MUY (EMDB 24026)。gydF4y2Ba

生成了以下数据集gydF4y2Ba

工具书类gydF4y2Ba

决定信gydF4y2Ba

  1. 爱德华埃格尔曼gydF4y2Ba
    美国弗吉尼亚大学评论编辑gydF4y2Ba
  2. Bavesh D假名gydF4y2Ba
    高级编辑;南非威特沃特斯兰德大学gydF4y2Ba
  3. 彼得·克里斯蒂gydF4y2Ba
    评论家gydF4y2Ba

为了提高透明度,eLife会发布最实质性的修订请求以及相应的作者回复。gydF4y2Ba

验收总结:gydF4y2Ba

作者通过单粒子冷冻电子显微镜解析了与军团菌Dot/Icm IV型分泌系统相关的外膜-核心复合物的结构。精细结构确定了该复合物的几个新的重要特征。这些特征包括三个以前未识别的组分和来自Dis1亚单位,似乎垂直延伸,并可能将复合体固定在外膜上。该论文为IV型分泌系统提供了新的见解,因此将引起许多从事细菌发病机制研究的人的兴趣。gydF4y2Ba

同行评审后的决定书:gydF4y2Ba

感谢您提交您的文章“Cryo EM揭示嗜肺军团菌Dot/Icm T4SS中新的物种特异性蛋白质和对称元素”,供gydF4y2Ba艾利夫gydF4y2Ba。您的文章已由两位同行评论员审阅,评议由一位评议编辑监督,Bavesh Kana担任高级编辑。以下参与审阅您提交的文章的个人已同意透露其身份:Peter Christie(评论员#2)。gydF4y2Ba

审稿人已经互相讨论了他们的评论,审稿人已经起草了这篇文章来帮助你准备修改后的提交。gydF4y2Ba

基本修订:gydF4y2Ba

1) 尚未进行检测Dot/Icm T4SS介导的蛋白质易位的功能分析。这是证明主要结论的必要条件。否则,主要结论需要淡化。gydF4y2Ba

2)完整的Dot/Icm T4SS包含31份DotF(第206行)和16份DotG(第266行)的主张依据不明确。虽然在显示的结构中C16 dome主要由DotG组成(图5),但DotF和DotG都参与了C18 PR的组成(图3),作为内膜跨越蛋白。如何在PR中提供额外的2个分子(18-16 = 2)DotG ?gydF4y2Ba

3)在C13 OMC和C18 PR之间,在三个独立的平面上有不同的拷贝数(图4),并且在OMC中,它的c端结构域显示出显著的构象灵活性(图4 supplementary 6)。它的n端结构域似乎稳定地与C18 PR(视频1)、DotG(图3 Supplement 3)和DotF(图3 Supplement 4)相匹配。这使得人们认为PR定义了每个组成蛋白的拷贝数。根据之前定义的化学计量学(Durie et al., 2020), 2:1:1 (DotD: DotC: do),这项研究是否可以确定单个Dot/Icm T4SS结构的DotD, DotC, DotC, DotG和DotF的可能拷贝数?gydF4y2Ba

4)本研究新发现的成分(Dis2、Dis3和Dis1)的功能意义应通过删除效应易位分析的基因来阐明。gydF4y2Ba

其他建议:gydF4y2Ba

2.图1所示。增刊。2。面板A是无信息的,可以删除。gydF4y2Ba

3.图2。标题暗示不止一个不对称的单位,但只有一个在不同的方向显示。gydF4y2Ba

4.图2.补充说明2,3.如果左边的蛋白质名称列在正上方或正下方,这将对读者有用。gydF4y2Ba

5.图2补充。4.Dis1的预测脂质化位点位于异常长的信号序列之后,应重新评估该分配,或更好地通过棕榈酸酯标记、诱变或两者同时确认。gydF4y2Ba

6.图2,补充4。此外,α-螺旋构成细菌外膜的跨膜结构域的建议并非完全异端,例如VirB10 AP结构域,但并不常见。脂蛋白通过N-末端Cys残基锚定到OM,然后通过相邻的α-螺旋跨越OM,是否有先例Dis2的层,也被提议通过TMα-螺旋锚定OMC–这不是完整外膜蛋白的常见基序,明显原因是OM中没有Sec系统或YidC来协调TM螺旋插入。在这种情况下,也不建议显示TM螺旋预测算法的结果对于具有α-螺旋的OM蛋白。gydF4y2Ba

7.图2,增补5。面板e见上面的评论。gydF4y2Ba

8.l . 140。将Dis1和Dis2作为锚定蛋白是高度推测的,很可能是错误的。需要进行突变分析来评估这些a-螺旋和Dis1的C42残基的重要性。gydF4y2Ba

9.l . 185。作者应该对DotG片段791-824与PR中的do的可能意义进行更多的评论。如果这种接触是真实的,这表明DotG也适应了穹顶和PR之间的对称不匹配,作者预测它们是稳定的还是动态的相互作用?gydF4y2Ba

10.L. 211和图4。在OMC中,中间空间和PR中的空间关系是令人困惑的,主要是因为作者不清楚哪些域组成了这些区域。如果我的理解是正确的,它应该更清楚地指出,有18份岂在整个结构,所有18“NTDs组成”相关的公关。13 ctd扩展构建OMC的一部分,而其他5只延长了部分隔开的空间。对吧?gydF4y2Ba

11.图4。如果这一解释是正确的,那么为什么作者认为5个悬浮在OMC和PR之间的tds会给PR带来构象上的灵活性?gydF4y2Ba

12.由于从嗜肺L.分离出来的复合物不处于效应体易位状态(不处于感染状态),我认为作者可能需要缓和关于灵活结构域模型的说法。gydF4y2Ba

13.DotK和Lpg0657不仅在他们最近的报告(Durie et al., 2020)中被描述为与T4SS核心复合物相关的蛋白,而且Ghosal等人,2019 (DotK)和Kubori等人,2014(表S1, DotK和Lpg0657)。应引用原始报告。gydF4y2Ba

14.第74行“核心”一词应更仔细地描述。如果没有显示功能相关性的实验数据,结构中确定的相关蛋白质不应被描述为“核心成分”。gydF4y2Ba

15.由于从嗜肺L.分离出来的复合物不处于效应体易位状态(不处于感染状态),我认为作者可能需要缓和关于灵活结构域模型的说法。gydF4y2Ba

16.DotK和Lpg0657不仅在他们最近的报告(Durie et al., 2020)中被描述为与T4SS核心复合物相关的蛋白,而且Ghosal等人,2019 (DotK)和Kubori等人,2014(表S1, DotK和Lpg0657)。应引用原始报告。gydF4y2Ba

17.第74行应该更仔细地描述“核心”这个术语。如果没有显示功能相关性的实验数据,在结构中识别的相关蛋白不应被描述为“核心成分”。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.7554/eLife.70427.sa1gydF4y2Ba

作者的反应gydF4y2Ba

基本修订:gydF4y2Ba

1) 尚未进行检测Dot/Icm T4SS介导的蛋白质易位的功能分析。这是证明主要结论的必要条件。否则,主要结论需要淡化。gydF4y2Ba

我们感谢审稿人的反馈。我们已经修改了手稿,以弱化我们的结论,并确保添加了限制性陈述,明确地提请读者注意哪些仍然需要额外实验的假设。这些变化已经在“摘要”和“结果和讨论”部分做出。gydF4y2Ba

2)完整的Dot/Icm T4SS包含31份DotF(第206行)和16份DotG(第266行)的主张依据不明确。虽然在显示的结构中C16 dome主要由DotG组成(图5),但DotF和DotG都参与了C18 PR的组成(图3),作为内膜跨越蛋白。如何在PR中提供额外的2个分子(18-16 = 2)DotG ?gydF4y2Ba

我们对造成的混乱表示歉意。我们已将手稿更新为:gydF4y2Ba

“基于PR内模拟的DotG结构(残基791-824)和符合穹顶密度的同源模型(约由残基857-1046组成),我们假设DotG从PR延伸到穹顶,但未观察到两个结构之间的物理连接。这将导致完整的Dot/Icm T4S中共有18个DotG副本,其中两个DotG副本可能由于结构异质性而无法在穹顶内显示。”gydF4y2Ba

3)在C13 OMC和C18 PR之间,在三个独立的平面上有不同的拷贝数(图4),并且在OMC中,它的c端结构域显示出显著的构象灵活性(图4 supplementary 6)。它的n端结构域似乎稳定地与C18 PR(视频1)、DotG(图3 Supplement 3)和DotF(图3 Supplement 4)相匹配。这使得人们认为PR定义了每个组成蛋白的拷贝数。根据之前定义的化学计量学(Durie et al., 2020), 2:1:1 (DotD: DotC: do),这项研究是否可以确定单个Dot/Icm T4SS结构的DotD, DotC, DotC, DotG和DotF的可能拷贝数?gydF4y2Ba

我们感谢审稿人的建议,并在第2点的补充内容之后,直接在原稿中添加了以下内容:gydF4y2Ba

“总之,我们建议Dot/Icm T4SS的最终化学计量值为31:26:18:18:18:13:13:13:13 (DotF:DotD:DotG: DotC:DotK:Dis1:Dis2:Dis3)。”gydF4y2Ba

4)本研究新发现的成分(Dis2、Dis3和Dis1)的功能意义应通过删除效应易位分析的基因来阐明。gydF4y2Ba

我们感谢审稿人的反馈,并热烈同意需要对这些蛋白质的功能作用进行进一步研究。尽管这些实验正在进行中,但它们需要的时间和资源超出了当前研究的范围。如上所述,我们修改了手稿,以减弱我们的结论和结论确保添加限定性陈述,明确提请读者注意仍然需要额外实验的假设。此外,我们现在讨论其他实验室发表的关于Dis1和Dis3功能的研究的其他相关工作。我们没有发现与Dis2功能相关的研究。这是添加的文本:gydF4y2Ba

“之前的一项研究发现,一个转座子突变体打断了Dis1基因,导致菌株在液体培养中复制和野生型菌株一样,但两者都有细胞内生长缺陷gydF4y2Ba卡斯特拉尼gydF4y2Ba和骨髓来源的小鼠巨噬细胞,与Dis1在Dot/Icm T4SS功能中发挥重要作用一致(Goodwin等,2016)。gydF4y2Ba

Lpg2847是一个双基因操纵子的一部分gydF4y2Balpg2848gydF4y2Ba或gydF4y2Ba核内小rnagydF4y2Ba的一种核糖核酸酶gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2BaII型分泌系统(T2SS)两者的插入突变体gydF4y2BasrnAgydF4y2Ba和gydF4y2Badis3gydF4y2Ba并通过T2SS检测其分泌RNase的能力。的gydF4y2Badis3gydF4y2Ba突变体在原生动物宿主中没有生长缺陷gydF4y2Ba蠕形线虫gydF4y2Ba,一种被广泛接受的T2SS功能检测方法,但尚未对T4SS组装或功能进行专门测试(Rossier et al., 2009)。gydF4y2Ba

其他建议:gydF4y2Ba

2.图1所示。增刊。2。面板A是无信息的,可以删除。gydF4y2Ba

虽然我们感谢审稿人的反馈,但我们选择将该小组保留在补充数字中。根据我们的经验,许多读者更喜欢看到具有代表性的显微照片,这样他们可以直观地评估原始数据的质量。gydF4y2Ba

3.图2。标题暗示不止一个不对称的单位,但只有一个在不同的方向显示。gydF4y2Ba

我们感谢审稿人抓住了这个错误。已更正为仅显示一个不对称单元。gydF4y2Ba

4.图2.补充说明2,3.如果左边的蛋白质名称列在正上方或正下方,这将对读者有用。gydF4y2Ba

蛋白质名称现在直接列在左边面板的上方。gydF4y2Ba

5.图2增补。Dis1预测的脂化位点是在一个异常长的信号序列之后,这一分配应该重新评估,或者更好地通过棕榈酸标记、突变或两者同时确认。gydF4y2Ba

由于Dis1中的palmination站点只是被预测的(并没有实际分配或观察到),评论者认为命名该站点为时过早是正确的。为了解决这一批评,我们重新绘制了图,并更改了文本,使得图中只包含了之前文献中描述过的脂化位点,并在本文中进行了讨论。gydF4y2Ba

6.图2,补充4。此外,α-螺旋构成细菌外膜的跨膜结构域的建议并非完全异端,例如VirB10 AP结构域,但并不常见。脂蛋白通过N-末端Cys残基锚定到OM,然后通过相邻的α-螺旋跨越OM,是否有先例Dis2的层,也被提议通过TMα-螺旋锚定OMC–这不是完整外膜蛋白的常见基序,明显原因是OM中没有Sec系统或YidC来协调TM螺旋插入。在这种情况下,也不建议显示TM螺旋预测算法的结果对于具有α-螺旋的OM蛋白。gydF4y2Ba

7.图2,增补5。面板e见上面的评论。gydF4y2Ba

8.l . 140。将Dis1和Dis2作为锚定蛋白是高度推测的,很可能是错误的。需要进行突变分析来评估这些a-螺旋和Dis1的C42残基的重要性。gydF4y2Ba

我们同意审稿人的意见(6,7,8),即如果没有额外的研究,这仍然是一个推测模型。我们现在已经从手稿中删除了这些部分,因为它们需要大量的额外研究来验证这些假设。gydF4y2Ba

9.l . 185。作者应该对DotG片段791-824与PR中的do的可能意义进行更多的评论。如果这种接触是真实的,这表明DotG也适应了穹顶和PR之间的对称不匹配,作者预测它们是稳定的还是动态的相互作用?gydF4y2Ba

我们同意,在PR中观察到的DotG和do之间的相互作用是非常有趣的,可能会决定Dot/Icm T4SS的整体组织。不幸的是,我们无法从这些数据中确定这些相互作用的稳定性。然而,有趣的是,类似的相互作用在gydF4y2Bax citrigydF4y2Ba和gydF4y2Ba幽门螺旋杆菌gydF4y2BaCag T4SSs,可能表明所有T4SSs之间的这种相互作用具有重要功能。我们在手稿中注意到了这种相似性:gydF4y2Ba

“在PR中观察到的DotG/ DotG之间的相互作用在结构上与之前报道的VirB10/VirB9和CagX/CagY之间的相互作用相似,这可能反映了在PR中保留该组织的重要功能。”gydF4y2Ba

10.L. 211和图4。在OMC中,中间空间和PR中的空间关系是令人困惑的,主要是因为作者不清楚哪些域组成了这些区域。如果我的理解是正确的,它应该更清楚地指出,有18份岂在整个结构,所有18“NTDs组成”相关的公关。13 ctd扩展构建OMC的一部分,而其他5只延长了部分隔开的空间。对吧?gydF4y2Ba

这种理解是正确的。我方已纳入一份声明,概述了DotH NTD和CTD的组织/数量,从第234行开始,如下所示:gydF4y2Ba

“因此,在整个结构中有18个拷贝的do,所有18个ntd包括PR, 13个相关的ctd向上延伸构建部分OMC磁盘,其他5个ctd只向上部分延伸到中间空间。”gydF4y2Ba

11.图4。如果这一解释是正确的,那么为什么作者认为5个悬浮在OMC和PR之间的tds会给PR带来构象上的灵活性?gydF4y2Ba

位于OMC和PR之间的5个tdo ctd似乎是动态的,这些区域和其他Dot/Icm之间的方向发生变化。我们赞赏案文中没有明确说明这一点。为了向读者澄清Dot/Icm的哪些部分似乎是移动的,我们添加了以下文本:gydF4y2Ba

“在OMC和PR之间,每隔2到3个不对称单元就会出现一个中间的每个c端结构域,它们被观察到的程度是不同的,表明这些领域不是静态的位置对公关或OMC(图4 b和视频1)。这五个难道ctd的灵活性之间的对称不匹配观察表明一个机制,通过这个机制,OMC和公关可以容纳虽然无法推断出对称的效用不匹配。”gydF4y2Ba

12.由于从嗜肺L.分离出来的复合物不处于效应体易位状态(不处于感染状态),我认为作者可能需要缓和关于灵活结构域模型的说法。gydF4y2Ba

我们采纳了审稿人的建议,并替换了文本“基于对Dot/Icm T4SS如何调节对称性失配的理解,我们提出,在Cag T4SS中未发现的PR和OMC区域之间的灵活和/或动态连接对于Dot/Icm T4SS转运如此独特的大量分泌底物非常重要”,具体如下:gydF4y2Ba

“尽管我们现在能够描述对称性失配是如何适应的,但其对功能的影响仍有待确定。”gydF4y2Ba

13.DotK和Lpg0657不仅在他们最近的报告(Durie et al., 2020)中被描述为与T4SS核心复合物相关的蛋白,而且Ghosal等人,2019 (DotK)和Kubori等人,2014(表S1, DotK和Lpg0657)。应引用原始报告。gydF4y2Ba

我们感谢审稿人让我们注意到这个无意的oversite。我们现在已经引用了所有适当的参考资料,并不是有意省略重要的原始报告。gydF4y2Ba

14.第74行“核心”一词应更仔细地描述。如果没有显示功能相关性的实验数据,结构中确定的相关蛋白质不应被描述为“核心成分”。gydF4y2Ba

这一行删除了“核心”一词,因此该声明现在只指“新组件”,而不是“新核心组件”。gydF4y2Ba

15.由于从嗜肺L.分离出来的复合物不处于效应体易位状态(不处于感染状态),我认为作者可能需要缓和关于灵活结构域模型的说法。gydF4y2Ba

这个问题已经解决了(上面第12点)。gydF4y2Ba

16.DotK和Lpg0657不仅在他们最近的报告(Durie et al., 2020)中被描述为与T4SS核心复合物相关的蛋白,而且Ghosal等人,2019 (DotK)和Kubori等人,2014(表S1, DotK和Lpg0657)。应引用原始报告。gydF4y2Ba

这个问题已经解决了(上面第13点)。gydF4y2Ba

17.第74行应该更仔细地描述“核心”这个术语。如果没有显示功能相关性的实验数据,在结构中识别的相关蛋白不应被描述为“核心成分”。gydF4y2Ba

这一意见已得到处理(上文第14点)。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.7554/eLife.70427.sa2gydF4y2Ba

文章和作者信息gydF4y2Ba

作者详细信息gydF4y2Ba

  1. 迈克尔·J SheedlogydF4y2Ba

    1. 明尼苏达大学药理学系,美国明尼阿波利斯gydF4y2Ba
    2. 美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心病理、微生物和免疫学学系gydF4y2Ba
    贡献gydF4y2Ba
    形式分析,调查,方法,验证,可视化,写作-初稿,写作-审查和编辑gydF4y2Ba
    了同样的gydF4y2Ba
    克拉丽莎杜丽酒店gydF4y2Ba
    相互竞争的利益gydF4y2Ba
    没有宣布相互竞争的利益gydF4y2Ba
    ORCID图标gydF4y2Ba "此ORCID iD标识本文作者:"gydF4y2Ba0000-0002-3185-1727gydF4y2Ba
  2. 克拉丽莎杜丽酒店gydF4y2Ba

    美国密歇根大学生命科学研究所,美国安娜堡gydF4y2Ba
    贡献gydF4y2Ba
    概念化、数据整理、正式分析、资金获取、调查、方法学、验证、可视化、写作-原始草案、写作-审查和编辑gydF4y2Ba
    了同样的gydF4y2Ba
    迈克尔·J SheedlogydF4y2Ba
    相互竞争的利益gydF4y2Ba
    没有宣布相互竞争的利益gydF4y2Ba
    ORCID图标gydF4y2Ba "此ORCID iD标识本文作者:"gydF4y2Ba0000-0002-4027-4386gydF4y2Ba
  3. Jeong Min涌gydF4y2Ba

    1. 美国密歇根大学生命科学研究所,美国安娜堡gydF4y2Ba
    2. 韩国天主教大学生物技术学系,韩国京畿道gydF4y2Ba
    贡献gydF4y2Ba
    调查、方法、可视化gydF4y2Ba
    相互竞争的利益gydF4y2Ba
    没有宣布相互竞争的利益gydF4y2Ba
    ORCID图标gydF4y2Ba "此ORCID iD标识本文作者:"gydF4y2Ba0000-0002-4285-8764gydF4y2Ba
  4. Louise ChanggydF4y2Ba

    美国密歇根大学生命科学研究所,美国安娜堡gydF4y2Ba
    贡献gydF4y2Ba
    调查方法gydF4y2Ba
    相互竞争的利益gydF4y2Ba
    没有宣布相互竞争的利益gydF4y2Ba
  5. 杰奎琳·罗伯茨gydF4y2Ba

    美国密歇根大学生命科学研究所,美国安娜堡gydF4y2Ba
    贡献gydF4y2Ba
    形式分析,写作-审查和编辑gydF4y2Ba
    相互竞争的利益gydF4y2Ba
    没有宣布相互竞争的利益gydF4y2Ba
  6. 米歇尔SwansongydF4y2Ba

    美国密歇根大学微生物与免疫学系gydF4y2Ba
    贡献gydF4y2Ba
    概念,调查,方法,资源,验证,写作-审查和编辑gydF4y2Ba
    相互竞争的利益gydF4y2Ba
    没有宣布相互竞争的利益gydF4y2Ba
    ORCID图标gydF4y2Ba "此ORCID iD标识本文作者:"gydF4y2Ba0000-0003-2542-0266gydF4y2Ba
  7. 达纳·博登花边gydF4y2Ba

    1. 美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心病理、微生物和免疫学学系gydF4y2Ba
    2. 退伍军人事务部田纳西州山谷医疗保健系统,纳斯维尔,美国gydF4y2Ba
    贡献gydF4y2Ba
    形式分析,方法,资源,监督,可视化,写作-初稿,写作-审查和编辑gydF4y2Ba
    相互竞争的利益gydF4y2Ba
    没有宣布相互竞争的利益gydF4y2Ba
    ORCID图标gydF4y2Ba "此ORCID iD标识本文作者:"gydF4y2Ba0000-0003-2273-8121gydF4y2Ba
  8. 梅勒妮D OhigydF4y2Ba

    1. 美国密歇根大学生命科学研究所,美国安娜堡gydF4y2Ba
    2. 美国密歇根大学细胞与发育生物学系gydF4y2Ba
    贡献gydF4y2Ba
    概念化、数据整理、正式分析、资金获取、调查、方法论、资源、监督、可视化、写作-原稿、写作-审查和编辑gydF4y2Ba
    为对应gydF4y2Ba
    mohi@umich.edugydF4y2Ba
    相互竞争的利益gydF4y2Ba
    没有宣布相互竞争的利益gydF4y2Ba
    ORCID图标gydF4y2Ba "此ORCID iD标识本文作者:"gydF4y2Ba0000-0003-1750-4793gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

国家过敏和传染病研究所(R01AI118932)必威网球gydF4y2Ba

  • Jeong Min涌gydF4y2Ba
  • 杰奎琳·罗伯茨gydF4y2Ba
  • 达纳·博登花边gydF4y2Ba
  • 梅勒妮D OhigydF4y2Ba

国家过敏和传染病研究所(R21AI6465)必威网球gydF4y2Ba

  • 米歇尔SwansongydF4y2Ba
  • 梅勒妮D OhigydF4y2Ba

国家科学基金(DGE 1841052)gydF4y2Ba

  • 杰奎琳·罗伯茨gydF4y2Ba

国家过敏和传染病研究所(F32 AI150027)必威网球gydF4y2Ba

  • 克拉丽莎杜丽酒店gydF4y2Ba

国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(T32DK007673)gydF4y2Ba

  • 迈克尔·J SheedlogydF4y2Ba

美国国立卫生研究院(S10OD030275)gydF4y2Ba

  • 梅勒妮D OhigydF4y2Ba

美国国立卫生研究院K99AI154672gydF4y2Ba

  • 迈克尔·J SheedlogydF4y2Ba

美国国立卫生研究院(S10OD020011)gydF4y2Ba

  • 杰奎琳·罗伯茨gydF4y2Ba

国家科学基金(DGE1841052)gydF4y2Ba

  • 杰奎琳·罗伯茨gydF4y2Ba

资助方没有参与研究设计、数据收集和解释,也没有决定是否将研究提交出版。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

本文所描述的工作得到了NIH R01AI118932 (MDO)、R21AI6465 (MS和MDO)、F32 AI150027-01 (CLD)、NIH T32DK007673 (MJS)、K99AI154672 (MJS)、S10OD020011、S10OD030275、美国国家科学基金会DGE1841052 (JR)和密歇根大学微生物与免疫学系(Swanson)的支持。其中一些工作是由斯坦福大学、SLAC和美国国立卫生研究院S10仪器项目支持的斯坦福-SLAC低温电子显微镜设施完成的。内容完全是作者的责任,并不一定代表国家卫生研究院的官方观点。这里展示的分子图形和分析是用UCSF Chimera(由加州大学旧金山分校的生物计算、可视化和信息学资源开发,得到NIH P41-GM103311的支持)和ChimeraX(由加州大学的生物计算、可视化和信息学资源开发,美国国家卫生研究院R01-GM129325和美国国家过敏症和传染病研究所网络基础设施和计算生物学办公室的支持)。必威网球质谱实验由密歇根大学蛋白质组学资源设施进行。我们感谢T奈特gydF4y2Ba军团菌gydF4y2Ba文化的建议。我们感谢使用由M Su、A Bondy和L Koepping管理的U-M LSI低温电磁设备,以及U-M LSI IT支持。我们感谢U-M BSI和LSI对低温电磁设备的大力支持。gydF4y2Ba

高级编辑gydF4y2Ba

  1. Bavesh D Kana,威特沃特斯兰德大学,南非gydF4y2Ba

检查编辑器gydF4y2Ba

  1. 爱德华·H·埃格尔曼,美国弗吉尼亚大学gydF4y2Ba

评论家gydF4y2Ba

  1. 彼得·克里斯蒂gydF4y2Ba

出版的历史gydF4y2Ba

  1. 收稿日期:2021年5月16日gydF4y2Ba
  2. 预印本发布:gydF4y2Ba2021年6月18日(查看预印)gydF4y2Ba
  3. 接受日期:2021年9月14日gydF4y2Ba
  4. 接受的手稿发表:gydF4y2Ba2021年9月14日(版本1)gydF4y2Ba
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版权gydF4y2Ba

©2021,Sheedlo等。gydF4y2Ba

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韵律学gydF4y2Ba

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